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桑黄发酵条件的优化及其降尿酸活性的研究

赵立英  
【摘要】:痛风是生活中常见的一种代谢性疾病,容易造成患者关节红肿和关节疼痛,其病因主要在于机体内尿酸代谢异常。目前治疗痛风药物的作用机理主要是抑制尿酸合成途径,如别嘌呤醇和非布司他等,但其毒副作用明显,因此开发治疗痛风的新型天然药物成为国内外研究的重点。桑黄,又称桑臣、胡孙眼和桑黄菇,成分丰富,具有抗肿瘤、抗菌等多种功效,因其效果显著受到国内外研究者的青睐。本文以桑黄为研究对象,优化培养条件并提取活性成分,研究其降尿酸活性及机制。首先,制备含有不同浓度木质素的葡萄糖马铃薯培养基,并对桑黄菌种进行培养,根据桑黄的菌落直径、形态特征(固体培养)以及菌丝生长量(液体培养),筛选出0.06 g/L木质素最有利于桑黄的生长。在上述最佳培养条件下进行发酵并经过相应的处理得到胞外提取物(EEP)和胞内提取物(IEP)。通过细胞毒性实验MTT、荧光显微镜观察及细胞凋亡实验分别测定EEP和IEP对人正常肝脏细胞L02的细胞毒性。结果IEP浓度小于2.34g/L、EEP浓度小于3.15 g/L时具有非常小的细胞毒性。为进一步研究EEP和IEP降尿酸的效果,本文分别构建了高尿酸细胞模型和高尿酸动物模型。用次黄嘌呤构建高尿酸细胞模型。当次黄嘌呤浓度为67.5mg/L时,可以有效诱导尿酸合成过程中的关键酶XO和HGPRT的过表达,表明体外高尿酸模型构建成功。然后在此基础上,分别研究不同浓度的桑黄提取物对L02细胞中XO和HGPRT表达的影响,结果表明:2.34 g/L IEP和3.15 g/L EEP能够降低XO的表达并显著升高HGPRT的表达,这表明桑黄在体外条件下可以有效抑制细胞尿酸的合成。在体内条件下,本文分别利用酵母提取粉和尿酸钠(MSU)来构建高尿酸小鼠模型和高尿酸大鼠模型。对大鼠和小鼠进行桑黄提取物灌胃处理一段时间后,测定桑黄的体内降尿酸效果。结果显示:与阳性组相比,经桑黄治疗后的大鼠关节肿胀发生率明显减小,并且小鼠血尿酸也明显降低,这表明桑黄的提取物在动物模型上具有良好的降尿酸效果。尿酸形成过程中伴随着活性氧自由基(ROS)的产生,同时尿酸也是氧化应激的一种重要标志。因此本文进一步研究了桑黄的抗氧化作用效果以及其对细胞氧化应激的保护作用。结果表明,桑黄提取物具有很高的清除DPPH自由基、羟基自由基以及铁离子的能力。当EEP和IEP的浓度分别是25.0 g/L和4.69 g/L时,对DPPH自由基清除率分别为65%和80%;当EEP和IEP的浓度分别为6.30 g/L和4.69 g/L时,对羟基自由基的清除率分别为90%和76%;当EEP和IEP的浓度分别为25.0 g/L和18.75 g/L时,对铁离子的还原能力对应的OD值分别为1和1.3。然而,与上述自由基的清除能力相比,EEP和IEP对超氧阴离子的清除能力相对较弱:当EEP浓度为25.0 g/L、IEP浓度为18.75 g/L时,清除率仅为18%和42%。通过流式细胞仪(FACS)和荧光显微镜(fluorescence显微镜)分析,胡桃醌诱发的L02细胞氧化应激可以被EEP(3.15 g/L)和IEP(2.34 g/L)显著抑制。这些结果表明桑黄提取物具有很强的抗氧化活性同时能有效减弱尿酸产生过程中氧化应激的影响。综上所述,桑黄具有良好的降尿酸作用效果,其降尿酸的作用机理与其有效抑制细胞内XO和HGPRT的表达有关,同时其较高的抗氧化活性也将进一步提高其对痛风的治疗效果。本文还研究了木质素对桑黄生长的促进作用,对其培养基进行了优化。本研究将为桑黄抗尿酸药物方面的开发利用以及桑黄的生产奠定一定的研究基础。


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