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壳聚糖自组装递送体系的构建及其对活性物质的缓控效用

杜志阳  
【摘要】:本研究受到“十三五”国家重点研发计划项目《方便营养型蛋制品绿色加工关键技术研究及开发》(2018YFD0400300)资助。近年来,食源性活性物质因其无毒、易降解、在疾病预防和健康调节等方面所表现出的卓越功效而受到研究者的广泛关注。然而,食源性活性物质经口摄入后,必须克服胃肠道严酷环境中极端p H条件、复杂的消化酶系统、穿过小肠上皮黏液层屏障及小肠上皮细胞、以完整形式被转运至血液循环、到达作用靶点并累积到一定的量,才能在机体内发挥其独特的生理活性。这也导致多数食源性活性物质在体外实验中具备优越的功能活性,但在体内实验中却并没有发挥其应有的功效,表现出极低的体内生物利用度,极大地限制了食源性活性物质在食品工业和大健康产业中的广泛应用。随着纳米生物技术的快速发展,构建合理的递送控制策略对有效提升食源性活性物质的小肠完整吸收、提升其体内生物利用度意义重大,是食源性活性物质研究领域亟待解决的关键科学问题。因此,本文首先针对蛋清源活性肽在体内易被降解、完整吸收率低等问题,探究了不同制备条件对壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒的胶体特性及其对不同分子量组成的蛋清源活性肽包埋能力的影响,获得了壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒对蛋清源活性肽的包埋机理,评价了壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒对蛋清源活性肽的保护作用及促吸收效果。随后,为了改善壳聚糖的溶解性,本研究采用化学改性法获得了水溶性良好的L-精氨酸/L-赖氨酸/L-半胱氨酸/N-乙酰-L-半胱氨酸-壳聚糖,并将其作为亲水涂层与自聚集的蛋白内核通过层层自组装法制备得到了系列两亲性壳聚糖递送体系。新制备得到的两亲性递送体系具备良好的核-壳结构、p H响应特性以及对亲水和疏水活性物质优异的包埋、保护、控释、缓释和递送效用,为提升食源性活性物质的体内生物利用度提供了新思路,为食源性活性物质的深度研究和广泛应用提供了有力支撑。本文的主要研究内容和结论如下:(1)通过离子凝胶法制备并探究了壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒的胶体特性,研究了壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒对不同分子量分布的蛋清肽的包埋规律,通过傅里叶红外光谱(FTIR)法探究了壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒包埋蛋清肽的作用机制,最后验证了壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒对蛋清肽的保护及吸收促进作用。结果发现,壳聚糖初始浓度越高,制备得到的壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒的粒径就越大,对蛋清肽的包埋率和包埋能力也越高;随着环境p H值的增大,纳米颗粒的粒径及其对蛋清肽的包埋率和包埋能力也随之增大。研究发现,壳聚糖首先通过强烈的氢键相互作用和静电相互作用与蛋清肽彼此缠绕,加入三聚磷酸钠后形成了三重网络结构。当蛋清肽添加量较少时,带负电的蛋清肽有助于促进颗粒的内部收缩,形成更为稳定、均一的纳米颗粒体系;而随着蛋清肽添加量增多,纳米颗粒表面带正电的-NH_3~+逐渐减少,颗粒带电量减少,体系稳定性急剧下降。通过体外模拟消化法可知,壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒能够显著阻止胃肠消化酶系对蛋清肽的降解;由外翻大鼠肠囊吸收实验结果可知,壳聚糖-三聚磷酸钠纳米颗粒能够显著提升蛋清肽的完整吸收效率,提升蛋清肽的生物利用度。(2)采用两亲性氨基酸精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)分别对壳聚糖(CS)进行化学改性,通过Na OH修饰法对酪蛋白进行改性,得到水溶性良好的Arg/Lys-CS和CA。随后通过层层自组装法制备得到Arg/Lys-CS-CA纳米颗粒。结果发现,Arg/Lys-CS-CA纳米颗粒的最小粒径为110/82 nm,呈均一稳定的球状核-壳构型,具备良好的p H响应特性、28天贮藏稳定性和黏膜粘附性。Arg/Lys-CS-CA纳米颗粒具备优良的两亲性,对亲水活性物质蛋清肽的包埋率在81-91%和76-87%范围内,对疏水活性物质姜黄素的包埋率在35-74%和48-87%范围内;其中,Arg/Lys-CS作为亲水性外壳对亲水活性物质的包埋起主要作用,而CA作为两亲性内核具备较大的疏水性区域,对疏水活性物质的包埋起主要作用;纳米颗粒对亲水活性物质包埋的主要驱动力为分子间强烈的氢键作用和静电相互作用,对疏水活性物质的包埋则主要通过疏水相互作用和氢键相互作用实现的。体外缓释结果显示,Arg/Lys-CS-CA纳米颗粒能够显著提升蛋清肽和姜黄素的生物利用度,限制活性物质在胃部环境下的释放,但在肠环境下则能够实现缓慢释放;小鼠灌胃实验发现,Arg/Lys-CS-CA纳米颗粒能够显著提升姜黄素在小鼠血清中的含量,有效提升姜黄素的体内生物利用度。(3)采用含有巯基的小分子物质N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)和半胱氨酸(CYS)分别通过化学改性法对壳聚糖(脱乙酰度≥95%)进行改性,得到水溶性良好的壳聚糖衍生物NAC/CYS-CS,再通过层层自组装法制备得到两亲性NAC/CYS-CS-CA纳米颗粒。研究发现,NAC/CYS-CS-CA纳米颗粒的最小粒径为89/86 nm,拥有良好的p H响应性,在TEM下呈均一的球状结构。NAC/CYS-CS-CA纳米颗粒具有优异的两亲性,对蛋清肽的包埋率在39-67%和51-63%,对姜黄素的包埋率在45-58%和48-63%范围内;纳米颗粒以强烈的氢键相互作用和静电相互作用实现对蛋清肽的有效包埋,通过疏水相互作用和氢键相互作用实现对姜黄素的有效包埋。体外缓释结果和小鼠灌胃吸收实验均表明,NAC/CYS-CS-CA纳米颗粒对活性物质有良好的控释、缓释和持续释放特性,能够有效提升姜黄素在Caco-2细胞胞内吸收及小鼠血清中的含量,可有效提高活性物质的体内生物利用度。(4)使用NAC/CYS对壳聚糖(脱乙酰度为75-85%)进行改性,制备并鉴定得到了NAC/CYS-CS。以β-乳球蛋白(β-lg)为交联剂,通过戊二醛法首先使β-lg发生自聚集,而后通过层层自组装法制备得到NAC/CYS-CS-β-lg纳米颗粒。研究发现,该纳米颗粒最小的粒径为118/48 nm,具备良好的p H响应性和体系稳定性,相比NAC/CYS-CS-CA纳米颗粒而言,显著改善了体系在p H 6条件下的稳定性。NAC/CYS-CS-β-lg纳米颗粒具备两亲性,对蛋清肽的包埋率在51-89%和50-81%范围内,对姜黄素的包埋率在42-57%和41-57%范围内;纳米颗粒通过强烈的氢键相互作用和静电相互作用对蛋清完成包埋,通过疏水相互作用和氢键相互作用完成对姜黄素的包埋。其中,NAC/CYS-CS对蛋清肽的包埋起主要作用,因此纳米颗粒对亲水活性物质的包埋率具备p H响应性;而自聚集的两亲性β-lg内核对姜黄素的包埋起主要作用,但也能够在一定程度上包埋亲水活性物质,因此纳米颗粒对疏水活性物质的包埋率不具备p H响应性。体外缓释结果表明,NAC/CYS-CS-β-lg纳米颗粒能够限制亲水和疏水活性物质在胃部条件下的快速释放,有效促进活性物质在Caco-2细胞单层膜上的快速转运,有效提升活性物质的体内生物利用度。NAC/CYS-CS-β-lg纳米颗粒对蛋清源活性肽QIGLF的吸收效率提升最高可达2.04倍和4.56倍;对姜黄素的表观渗透率则可分别达到7.45×10~(-6) cm/s和6.94×10~(-6) cm/s。


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