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新型冠脉可降解支架材料PLGA,PLGA-PEG与兔血管平滑肌细胞相容性的研究

张基昌  
【摘要】:冠状动脉介入治疗已成为重要的治疗冠状动脉粥样硬化导致的血管狭窄的一种手段。但是介入治疗并发的血管再狭窄严重影响了治疗效果及该技术的进一步发展。可降解支架为有效的预防、控制及治疗再狭窄的提供了新的方法,成为国内外研究比较活跃的领域。我们体外培养的兔血管平滑肌细胞种植在PLGA,PLGA-PEG模片,探讨PLGA,PLGA-PEG细胞相容性,为生物可降解材料在冠心病介入治疗的应用,提供实验室依据。 目的:探讨新型冠脉可降解支架材料PLGA,PLGA-PEG与血管平滑肌的细胞相容性,为PLGA,PLGA-PEG作为冠脉可降解支架材料的研究提供实验室依据。 方法:采用体外培养的兔血管平滑肌细胞,用相差显微镜观察细胞形态,免疫组化染色鉴定,证明培养的细胞是血管平滑肌细胞,以1.0*105/L种植在PLGA,PLGA-PEG模片上,并与空白对照组比较,用相差显微镜观察细胞的生长情况,每天计数,绘制细胞生长曲线,以1.0*105/L密度接种96孔板上,分别于第1、3、5、7天,用MTT法测定细胞增值指数,以3.0*105/L密度接种6孔板上,7天后流式细胞仪检测细胞周期分布,检测结果采用平均值±标准差,组间计量资料采用t检验,P0.05,有显著意义。 结果:兔血管平滑肌细胞在PLGA,PLGA-PEG模片生长良好,第1至第7天细胞计数分别为(对照组: 1.00±0.00, 5.60±0.48, 6.64±0.20, 7.21±0.15, 7.40±0.36, 8.99±0.39, 9.59±0.3;PLGA组:1.00±0.00,5.32±0.23,6.52±0.35,7.04±0.32,7.25±0.12,8.72±0.39,9.24±0.31;PLGA-PEG组:1.00±0.00,5.44±0.21,6.31±0.45,7.01±0.31,7.14±0.22,8.62±0.32,9.14±0.82),PLGA,PLGA-PEG模片细胞数较对照组略少,但P0.05,无明 WP=31 显差异;MTT法测定细胞增值指数,对照组与PLGA组、PLGA组与PLGA-PEG组统计学检验,P0.05,无明显差异,流式细胞仪测细胞周期,显示PLGA,PLGA-PEG及对照组DNA含量与细胞周期各时相分布,PLGA,PLGA-PEG对细胞增值活性无明显影响。 讨论:早期单纯球囊成形术后的再狭窄率大约为30%~50%。采用冠状动脉内支架置入技术,虽然降低了血管急性闭塞的发生率,但仍然有远期再狭窄,半年内再狭窄率约为10%-30%。这一缺点严重制约了冠状动脉介入治疗的临床应用。可降解生物支架克服了金属支架一些致命的不足,如金属表面的负电荷吸附血小板于支架内,导致亚急性血栓形成;金属支架作为一个永久的异物,在体内长期存留,可引起血管的慢性损伤,可造成血管中层萎缩、动脉瘤形成,通过金属支架与血管壁之间的金属腐蚀作用,加强对血管平滑肌细胞的刺激,使其过度增生,导致再狭窄。生物可降解支架能够在血管损伤愈合的特定时间内完成对血管力学支撑后不存留,并且能够载荷各种物质给予病变段血管足够的机械支撑的同时促进血管的再生调理,为解决再狭窄提供了新方向。 本实验研究由中国科学院长春应用化学研究所研制成功生物降解高分子作为血管支架材料,首选高分子量的PLLA、PLGA及其与PEG的嵌段共聚物,它们在血浆中的降解时间在4~8周,拉伸强度20MPa以上,断裂伸长50%以上。生物可降解材料高分子量的PLLA、PLGA及其与PEG的嵌段共聚物,生物降解速度可调(2月~1年),本身具有形状记忆功能,在室温到体温的范围内可以按需要改变形状和大小,或者使形状和大小固定下来,从而满足冠状动脉内置支架的基本要求。本研究主要从细胞生物学入手,通过动物实验,研究PLGA,PLGA-PEG可降解支架与兔血管平滑肌的相容性。 评价材料细胞相容性通常采用体外细胞培养的方法将细胞种植在材料或其浸液中,观察细胞的生长情况,并测定细胞代谢功能。本实验采用体外 WP=32 培养兔血管平滑肌,将血管平滑肌细胞培养在 PLGA,PLGA-PEG模片上,与对照组比较,从体外研究结果评价其细胞相容性,从平滑肌细胞形态学改变反应细胞生长过程。从本实验中发现,兔血管平滑肌细胞在培养早期贴壁较对照组略慢,主要集中在模片的四周,对照组较均匀,中期及后期细胞增长趋于稳定,增长程度无明显低于无模片组,同时生长形态符合血管平滑肌生长规律,无细胞衰老及异常分裂现象,表明可降解材料PLGA,PLGA-PEG作用下,血管平滑肌细胞增生性变化与自然状态大致相同,PLGA,PLGA-PEG无明显抑制血管平滑肌细胞的增生,具有良好的细胞形容性。 MTT法在细胞生物测定中是一种快速、简便鉴别、统计细胞死(或活)的方法。主要原理是线粒体的琥珀酸脱氢酶能催化黄色的四甲基偶氮唑盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)3,5-diphenyltetrazo-liumbromide,MTT〕形成兰紫色的甲臢颗粒,这种反应仅发生于线粒体的琥珀酸脱氢酶系统完好的活细胞中, 甲臢生成的量与活细胞数目呈正相关。在本实验中,可见活细胞与凋亡细胞数目无显著差异,表明PLGA,PLGA-PEG无明显的细胞毒性作用,故活细胞内的线粒体琥珀酸脱氢酶无降低,能够还原的紫黑色甲臢颗粒无减少,最终溶解液的光密度值无明显差异。 DNA含量的测定可作为凋亡细胞鉴定的方法及识别细胞周期中凋亡过程的特性.应用流式细胞仪测定细胞DNA含量及细胞周期各时相分布能快速、准确地对细胞增值活性做出评价。 细胞周期中不同时相反映细胞处?


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