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抗人膀胱癌抗独特型抗体佐剂疫苗的制备、鉴定、动物实验及临床初步应用研究

张明  
【摘要】:Nisonoff和Lamoyi在Jerne免疫网络学说基础上指出,有一类抗独特型抗体(抗Id抗体Ab2),象抗原的表位那样,通过其独特位与Ab1的配位结合,实质上能替代抗原诱导特异性应答。这为将抗独特型抗体用于主动免疫治疗提供了思路。传统的治疗方法,如化疗、放疗并不能将患者体内所有癌细胞杀灭,这就是临床治愈后复发的原因。肿瘤治疗应调节机体免疫状态,改变瘤细胞的生长环境,使肿瘤生长繁殖受到抑制或发生逆转。因此,肿瘤的主动免疫治疗尤其重要。抗独特型抗体具有模拟抗原及免疫调节的双重作用,同时能克服机体免疫抑制,或打破免疫耐受状态,在肿瘤的治疗中有巨大的潜力。近年在国外己对黑色素瘤、大肠癌病人作过多次主动免疫研究,也制备了其它多种肿瘤的抗Id抗体。但膀胱癌的抗Id抗体尚属于空白。 本实验用人膀胱移行细胞癌细胞经匀浆及凝胶纯化技术制备抗人膀胱癌单克隆抗体(Ab_1)。抗人膀胱癌单克隆抗体(Ab_1)经胃蛋白酶水解制备抗人膀胱癌单克隆抗体的F(ab')_2片段,以抗人膀胱癌单克隆抗体的F(ab')_2片段免疫新西兰白兔,其血清经凝胶纯化后获抗人膀胱抗独特型抗体(Ab_2)。实验结果表明:经琼脂双扩实验证实,抗人膀胱癌单克隆抗体为IgG_1亚型。间接BLISA检查,抗人膀胱癌单克隆抗体与膀胱移行细胞癌细胞反应阳性;与膀胱腺癌、膀胱鳞癌及正常膀胱组织反应阴性。常规制备染色体数目为 吉林大学博士学位论文 96一106条。以上结果表明抗人膀肤癌单克隆抗体是针对膀脱移行细胞癌的 单克隆抗体。经间接ELISA实验证实,抗人膀耽癌抗独特型抗体(A bZ)与 抗人膀肤癌单克隆抗体呈阳性反应,与BALB/C小时r球蛋白呈阴性反应。 中和实验表明,抗人膀耽癌单克隆抗体的F(。。·)2片段可以中和抗人膀肌癌 抗独特型抗体,故认为抗人膀肤癌抗独特型抗体是针对抗人膀脱癌单克隆的 可变区中的独特型的。竞争抑制实验结果表明,将系列稀释的膀肤癌抗原加 入抗人膀耽癌单克隆抗体包被的反应板中,孵化后,取抗人膀脱癌抗独特型 抗体及兔IgG分别加入反应板中后加入抗人膀耽癌抗独特型抗体的OD值随 膀肌癌抗原剂量的递减而增加,而正常兔IgG对照OD均为低值,无此现象, 提示抗人膀耽癌抗独特型抗体与膀胧癌抗原竟争结合抗人膀脱癌单克隆抗 体。将系列稀释的抗人膀肤癌抗独特型抗体及兔工gG分别与等量抗人膀肤癌 单克隆抗体混合,孵化后加入抗原包被反应板中,结果所测0D值随抗人膀 胧癌抗独特型抗体剂量的减少而增加,而正常兔IgG对照的OD值均为高值, 无此现象。抑制率随抗人膀肤癌抗独特型抗体剂量的递减而递减。提示:抗 人膀肌癌抗独特型抗体抑制抗人膀肤癌单克隆抗体与膀耽癌抗原的结合。故 抗人膀肌癌抗独特型抗体是具有膀耽癌抗原内影象的抗独特型抗体。 用己制备的抗人膀耽移行细胞癌抗独特型抗体,配以新型免疫佐剂 (sAF佐剂)制成佐剂疫苗进行动物实验研究和临床初步应用。本试验中采 用新型免疫佐剂取代传统的Al(OH)。佐剂,佐剂由苏氨酞胞壁酞二酞、Tween 80、角鳖醇等组成。由于其双亲性和表面活性剂的作用,抗原在乳滴的表面 排列,使抗原更好地靶向抗原递呈细胞(APCs),并更有效的递呈到淋巴细 胞,可活化补体及诱导一系列细胞因子的产生。用于临床试验已取得了与动 物试验相平行的结果。本研究中动物试验建立正常免疫小鼠荷人膀肌癌模 型:将新鲜肿瘤组织移植于接受抗独特型抗体免疫治疗的小鼠肾包膜下后分 别于移植后第2、4、6、8、10天处死。行移植瘤组织学观察和抗抗独特型 抗体(Ab:)检测。组织学检察时每块移植瘤行连续切片,观察移植瘤内宿 主淋巴细胞浸润情况及瘤细胞可见率。抗抗独特型抗体(Ab,)检测采用酶 ︾夕 以了 吉林大学博士学位论文 连免疫竞争抑制法计算抑制率。结果发现:实验组浸润淋巴细胞显著较对照 组增多,差异有显著性;实验组与对照组瘤细胞可见率比较,差异有显著性; 实验组Ab3均为阳性,而对照组为假阳性或阴性。表明:抗独特型抗体作为 肿瘤抗原免疫小鼠后,可产生对人膀脱癌特异性体液和细胞免疫反应,排斥 肿瘤细胞。同时,也可推测,膀脱癌Ab:可以用于膀肌癌的主动免疫治疗, 也可以用于预防临床治愈后的肿瘤复发,为膀肤癌的治疗,提供新的方法。 新型佐剂疫苗的临床初步应用前需先经过安全性检测,即必须进行细菌、支 原体、热原质检测,进行单剂量毒理实验,求药物的半数致死量等。上述安 全性检测证实新型佐剂疫苗的安全性后,才可应用于临床。取接受抗独特型 抗体主动免疫治疗后的病人血清,检测TNF、IFN一丫、IL一2等各项细胞因子 水平及NK细胞活性。结果表明:与对照组相比,用膀耽癌Ab:主动免疫膀 肤癌病人的免疫指标上升,有增强免疫功能的作用,可能是一种有效的辅助 疗法。同其他免疫治疗一样,AbZ不能取代常规手术治疗、化疗和放疗。当 肿瘤巨大,多处转移时,AbZ难以发挥作用;还需通过手术治疗,使肿瘤负 荷减至最小时再应用Ab:,以提高机体的免疫功能,杀伤残余肿瘤细胞。此 外,Ab:与各种细胞因子、主要组织相容性复合物分子,以及刺激分子联合


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