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糖尿病视网膜病变中M(?)ller细胞bFGF的表达及其机制的研究

冷瀛  
【摘要】:糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病微血管并发症最严重的病变之一。增殖型糖尿病视网膜病变(PDR)以视网膜新生血管和纤维化为特征,最终可导致视网膜脱离,患者视力丧失,成为临床上致盲的主要原因。因此,对DR发病机制及防治的研究已经成为目前国内外的研究热点。新生血管形成是DR微血管病变的主要标志,分子生物学研究证实了生长因子在DR发生、发展中起到了非常关键的作用。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为强有力的内皮细胞分裂因子,除在促进内皮细胞增殖外,还能调节细胞外基质代谢、促进胶原Ⅱ、Ⅲ的降解。因此,bFGF在促进新生血管形成中发挥了重要作用,几乎作用于新生血管形成的全过程。而且bFGF在PDR的早期即发挥了重要作用,早于VEGF。二者不仅具有协同作用,bFGF还可以诱导内皮细胞表达VEGF。bFGF的靶器官除了血管内皮细胞、周细胞,还有色素上皮细胞和Müller细胞。其中,Müller细胞是视网膜胶质细胞的主要成分,从内界膜延伸到外界膜,贯穿于整个视网膜,对视网膜起支持、营养的作用,参与维持视网膜的完整性,最易于受异常生物学行为的影响,参与多种病理过程。DR的发病是一个很复杂的病理过程,一般认为,持续的高血糖是DR发生的先决条件,也是始动因素,血糖高低与DR呈正相关。因此,本实验通过兔糖尿病动物模型,研究糖尿病状态下,bFGF在视网膜细胞中表达的定位,以明 吉林大学博士学位论文 确DR形成过程中bFGF表达的变化。进一步以兔视网膜Muller细胞 为实验模型,探讨在高糖状态下,Nmller细胞分泌bFGF的变化及其 机制,以达到早期控制bFGF的产生进而治疗DR的目的,为临床工 作提供理论依据,对及早防治DR,降低DR的发病率,提高糖尿病 病人的生存质量具有重要意义。 一发现糖尿病动物模型视网膜并未发生明显的形态学改变时存 在bFGF的表达,证实bFGF在PDR的早期即发挥作用。本实验采用激 光共聚焦免疫荧光双重标记技术,研究糖尿病兔视网膜bFGF的表达 及定位,发现bFGF与GR印共同表达于同一细胞,说明糖尿病早期时 视网膜M叨er细胞即分泌bFGF。 二.建立体外培养兔视网膜Muller细胞的实验模型,排除体内因 素影响以进一步研究高糖条件下视网膜Muller细胞分泌bFGF的情 况。本实验经体视显微镜、培养基筛选,以及通过传代培养获得纯度 较高的Nmller细胞。由于目前缺乏Nmller细胞特异性抗体,鉴定Muller 细胞需依赖联合鉴定的方法。经G异印、5- 100、VII因子相关抗原、肌 细胞特异性肌动蛋白的免疫细胞化学染色,PAS染色,透射电镜,及 GFAP的免疫荧光染色证实,以组织块悬浮法获得的细胞为Muller细 胞,其纯度达95%,为进一步研究提供成功的体外实验模型。 三.利用免疫细胞化学方法、RT一PCR方法观察5众mM高糖对体 外培养的视网膜Nluller细胞bFGF表达的影响。免疫细胞化学结果 发现,高浓度葡萄糖培养视网膜MOller细胞3天,bFGF蛋白质表达 (灰度值为1 92.4巧.6)与正常对照组(灰度值为170.3鲜.7)相比, 具有显著性差异(称0.01);通过RT.pCR方法,观察到50mM葡萄糖 培养Nmller细胞3天组与正常对照相比bFGF mRNA表达水平明显 上调护。.01)。c目phos石nC为特异性PKC抑制剂,soulM葡萄糖 +50川叨CalPhostinC组与50血M葡萄糖组相比MOner细胞bFGF 乡了 吉林大学博士学位论文 mRNA表达明显减少(尸0.01),说明高糖引起视网膜MOller细胞bFGF 表达的增加一部分是通过PKC途径激活产生的,抑制PKC的活性可 以抑制bFGF的产生,而达到抑制新生血管形成的作用。 四.采用TUNEL法检测凋亡细胞,结果发现,在糖尿病组视网 膜内核层可见凋亡阳性细胞,由于N恤11er细胞胞体位于内核层,说明 在糖尿病视网膜病变中可能存在着Nmller细胞的凋亡。50mM葡萄糖 培养Muller细胞3天,透射电镜下深染细胞明显增多,细胞表面的微 绒毛减少,变钝。细胞核缩小、不规则,核内常染色质增多,可见到 染色质形成大小不等的的团块凝结、边聚于核膜处。胞质深染,可见 高度扩张的粗面内质网。线粒体肿胀,晴断裂,呈空泡状改变。胞质 内可见残余体。胞质的深染、细胞器的损害、细胞表面微绒毛的减少 都表明细胞功能己发生减退。染色质边集是细胞凋亡典型的超微结构 特征。说明高糖长时间作用于M公ller细胞,引起视网膜Muller细胞的 凋亡而导致功能下降。该结果进一步证实TUN旧L实验中内核层的凋 亡阳性细胞部分为M皿‘细胞。 五‘实验应用全细胞膜片钳技术,观察了Na+通道和Caz+通道, 以发现高糖对视网膜MOller细胞离子通道的影响。结果发现,在高 糖条件下,峰值Na+电流与正常对照相比明显降低(尸0.01),降低 了25.58%。说明高糖使MUller细胞Na斗通道的开放概率降低,Na+内 向电流减少,这可能是Moller细胞功能发生变化的一种早期机制。 细胞C矛+通道开放概率没有明显变化,其中一个原因可能与研究例数 较少有关,另一个原因可能是高糖刺激了钙库内钙的释放,引发了C扩十 波,这种C扩十波担当了重要的钙信息传递,进而引起bFGF的分泌。 本实验采用激光共聚焦免疫荧光双重标记技术,研究糖尿病兔视 网膜bFGF的表达及定位,发现bFGF与GEA


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