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网状分枝扩增技术检测EB病毒基因的方法建立及临床应用研究

张福明  
【摘要】:本研究建立了网状分枝扩增(ramification amplification method, RAM)技术检测EB病毒基因的新方法。并应用该方法检测了非霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌患者外周血中EB病毒基因。 网状分枝扩增法是利用环形探针,在PCR基础上进行的基因扩增方法。环形探针是一种设计独特的核酸探针,它包括三个区域:5’和3’端与靶核酸互补序列和位于5’和3’端之间的基因连接区,一旦环形探针与靶基因杂交,它的5’端和3’端在DNA连接酶的作用下环形探针闭合成环形,呈螺旋状缠绕在靶基因上,然后,延着环形探针,DNA聚合酶延伸连接的正向引物,置换下游链,产生多聚ssDNA,以多聚ssDNA作为模板,反向引物与它杂交、延长、置换下游链,产生大的分枝DNA复合物,使RAM产物呈指数级扩增。 方 法: RAM方法:将待检的细胞溶于5M GTC溶液中,60℃ 1h,37℃过夜(使蛋白变性,核酸酶失活,双链DNA结构疏松),将待检标本(或靶基因)与环形探针、捕获探针及杂交缓冲液充分混匀,55℃条件水浴1h,加入磁珠,通过捕获探针上结合的生物素与磁珠表面的链霉素抗生物素蛋白结合,通过磁性分离捕获探针-靶基因-环形探针复合物,用TE缓冲液洗涤磁珠,去除未杂交的探针和细胞成分,加入Taq DNA连接酶,60℃ 20min,使环形探针的5,和3,端对合形成环形,固定在靶基因上,加入RAM引物、Bst DNA多聚酶、dNTP、T4基因蛋白、DMSO、杂交缓冲液,63℃ 1h,然 WP=98 后95℃加热灭活Bst DNA多聚酶,取RAM扩增产物加入EcoR I酶切,37℃过夜,2%的琼脂糖凝胶电泳分析。 RAM方法敏感性实验:用人工合成的EBER-1的特异性序列分别作不同浓度(108 107 106 105 104 103 102 101)稀释,以此作为靶基因用以检测RAM方法的敏感性。 PCR检测法:反应体系为50ul,反应混合物含5ul10×PCR缓冲液、300μMdNTP、0.6pmolPCR上、下游引物,2u Tag DNA聚合酶、和0.1μg样品DNA,反应条件为94℃5min,94℃ 1min、54℃ 1min、72℃ 1min共35轮循环,末次循环后72℃ 5min,2%的琼脂糖凝胶电泳。 原位杂交法:取制备好的细胞涂片,以生物素标记的探针(RAM法的捕获探针相同)检测细胞中的EBER-1基因。按试剂盒说明书操作(购于鼎国生物工程有限公司)。 统计学方法:采用田口玄一的积累方差分析法进行统计学分析。 结 果: 1.RAM的敏感度高、特异性强、方法简便易行、不需特殊设备,更适用于在基层医疗单位推广应用。 RAM具有高度的敏感性:RAM扩增产物是以指数方式扩增的,可将极微量的DNA扩增到紫外光可见的水平,经实验证实RAM最少能够检出10个分子的靶基因,其灵敏度与PCR法一致。 RAM具有高度的特异性:在RAM反应中,闭合环形探针的形成是以环 形探针与靶DNA特异性结合为前提,因此明显地提高了反应的特异性,另外引入捕获探针采用磁性分离杂交复合物,也增加了反应的特异性,因为靶DNA通过特定序列与捕获探针杂交后,从而形成靶DNA-环形探针-捕获探针复合物,被捕获到磁珠上,从而更增加了RAM反应的特异性。 RAM简便、易行、不需要特殊设备:在RAM反应中使用磁珠,通过磁 WP=99 性分离方法废弃了以往烦琐的人工DNA提取过程,探针两端的连接与靶核酸的性质(DNA和RNA)无关,因而无须在检测RNA时进行反转录,克服了PCR法需要将RNA反转录为cDNA的过程,可以应用简单的方式检测RNA和DNA;由于扩增产物为ssDNA,无需象PCR反应中必需通过改变温度使双链DNA变性、退火、引物延伸的温度循环过程,使得反应可在最简单的水浴箱内进行,无需价格昂贵的PCR仪,因此RAM更简便、易行,易于推广应用。 2.EB病毒感染与NHL具有较高的相关性。应用RAM检测了120例NHL患者外周血EB病毒基因,其检出阳性率为63.33%(T-NHL为63.29%,B-NHL为63.41%),而健康对照组EB病毒基因的检出阳性率为3.33%。我们的结果中,T-NHL的EB病毒检出率接近并且高于国内外研究者的报道,而B-NHL的检出阳性率明显高于国内外研究者的报道,说明EB病毒感染与NHL的发生具有较高的相关性,且本地区EB病毒感染与NHL发生的相关性高于国内其它地区。 3.EB病毒感染与NPC高度相关。应用RAM检测了32例鼻咽癌患者外周血EB病毒基因,其检出阳性率为87.5%,与健康对照组相比具有显著性差异,我们的结果与国内外研究者所报道的阳性率相一致,说明本地区鼻咽癌的发生与EB病毒感染高度相关。 4.EB病毒感染与急性髓系白血病相关性不大。应用RAM检测了30例急性髓系白血病患者外周血EB病毒基因,其检出阳性率为3.33%,与健康对照组的阳性率相同,说明急性髓系白血病与EB病毒感染关系不大。 结 论: 1.RAM的敏感度高、特异性强、方法简便易行、不需特殊设备,更适用于在基层医疗单位推广应用。 2.EB病毒感染与NHL的发生具有较高的相关性,与急性髓系白血病 WP=100 及健康对照组相比有显著性差异,且本地区EB病毒感染与NHL发生的相关性高于国内其它地区。 3.EB病毒感染与NPC高度相关。与急性髓系白血病及健康对照组相比有显著性差异,我们的结果与国内外研究者所报道的阳性率相一致,说明本地区鼻咽癌的发生与EB病毒感染高度相关。 4.EB病毒感染与急性髓系白血病相关性不大。与健康对照组?


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