2-甲氧雌二醇对子宫内膜癌抑制作用的实验研究

【摘要】：子宫内膜癌是发达国家女性生殖道最常见的恶性肿瘤。近年来在我国发病率也明显上升。由于雌激素与内膜癌的发生高度相关，内分泌治疗在激素受体阳性的患者中被广泛采用。但是，对于激素受体阴性的患者来讲，孕酮治疗效果不好；而且，化疗耐药问题也日益普遍。所以在肿瘤治疗领域寻求更有效的药物，也变得更加重要。 2-甲氧雌二醇（2-ME）是雌激素在体内的正常代谢产物，具有抑制血管生成和抗肿瘤的双重效果。在体外实验中，2-ME能够抑制许多肿瘤细胞的增殖 ；而且，在众多的动物肿瘤模型的体内实验中，2-ME 也表现出强有力的抑制肿瘤血管形成和抗肿瘤的功效。2-ME 目前应用到一些临床I 期和 II期实验中，商品名叫 Panzem ，是具有口服活性、小分子的血管生成抑制剂。应用到前列腺癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤等一些肿瘤的实验评估中。 与其它的雌激素代谢物不同，2-ME对激素受体的亲和力很微弱，雌激素的活性非常低，而且其对肿瘤抗增殖和细胞毒作用没有通过激素受体介导。2-ME在正常机体的药理学效应还不明确；确切的分子学作用机制还没有完全阐明。有研究表明，2-ME可以通过结合秋水仙碱结合位点而影响微管的聚合作用，干扰微管的稳定性；抑制超氧化物歧化酶的活性，增加活性氧的含量，产生细胞毒作用；还有学者认为，2-ME能使 WP=89 细胞在G2/M 期发生阻滞，延长细胞周期；上调死亡受体5；对快速生长的肿瘤细胞具有很强的促凋亡活性，通过直接诱导内皮细胞凋亡而抑制血管生成。2-ME所诱发的凋亡涉及凋亡的内部途径和外部途径。根据细胞的不同，采取的途径也不一样。重要的是，与其它的化疗药物相比，2-ME没有诸如脱发、肠道反应以及感染等副作用。 目前，还没有2-ME在子宫内膜癌方面的研究报道。本研究首次通过体外实验和体内实验,将2-ME引用到子宫内膜癌的治疗上，探讨其对内膜癌是否具有抗增殖、抑制血管生成和诱导凋亡的作用。鉴于此目的，我们选用了雌孕激素受体阴性的人子宫内膜腺癌KLE细胞株进行体外培养。体外实验研究表明，2-ME可以抑制 KLE细胞的增殖和血管形成能力，并诱导凋亡。 用增殖抑制实验（MTT）法来测定细胞增殖能力；集落形成实验用于判定单个细胞的繁殖能力；免疫组化方法测得Ki-67增殖指数。上述增殖实验表明，2-ME 显著抑制KLE细胞的生长，呈现浓度-效应和时间-效应依赖性。2.0μM2-ME的抑制作用接近于顺铂体外效应。 细胞凋亡在维持正常机体生理平衡中起着重要作用。凋亡受阻是肿瘤细胞的特征之一。诸多因素与凋亡调节相关，如p53基因和Bcl-2基因。野生型p53是肿瘤抑制基因，在诱导肿瘤凋亡中作用重大；突变型p53则是一个肿瘤促进基因；Bcl-2是凋亡抑制基因，通过磷酸化作用灭活其活性，从而使细胞发生凋亡。Bcl-2的磷酸化是微管干扰剂如泰素和2-ME治疗作用的一个特点。 2-ME 能够诱导 KLE 细胞发生凋亡。用流式细胞仪(FCM)检测细胞周期分布和细胞凋亡率；透射电镜观察细胞凋亡的形态学变化。2-ME孵育后的KLE细胞，随浓度升高发生 G1/S期阻滞增多，并出现凋亡峰升高，凋亡率加大。通过电镜可以观察到许多凋亡的特征性改变包括核染色质浓缩、趋边，核碎片和凋亡小体。线粒体的改变是凋亡的早期事件，其跨膜电位改变和通透性转换孔的开放是启动凋亡的关键。2-ME 孵育早期， WP=90 KLE细胞的线粒体即发生增多和肿胀。表明2-ME诱导的凋亡通过了线粒体途径。 现在研究表明，p53 的活化和Bcl-2的磷酸化在2-ME所诱导的凋亡中起了关键作用。c-jun 氨基端激酶(JNK)和 p38的活化是上调信号传导的关键。核反应因子NF B被2-ME激活，并受有丝分裂激动蛋白激酶p38的密切调节。抑制p38或 NF B，使得p53的诱导作用下降。JNK 是Bcl-2磷酸化所必需的；并通过JNK/激动蛋白 (AP)-1 途径作用于p53的诱导活化；同时p53的诱导也需要依赖p38的核反应因子NF B的活化。抑制JNK能够减弱2-ME诱导的 Bcl-2 的磷酸化和p53的活化，几乎完全抑制了凋亡。表明2-ME诱导的凋亡不仅需要p53的诱导（通过依赖p38/JNK 的NF B/AP-1激活）还需要依赖JNK的磷酸化。KLE细胞在2-ME孵育后， p53和 Bcl-2的阳性表达率明显下降。说明其所诱导的凋亡通过了p53途径，与文献报道相符。但是目前还不清楚的是每个分子在凋亡中所占的比重以及相互的信号作用。 肿瘤细胞对化疗药物耐药是化疗失败的主要原因。我们的研究表明，P-gp 与顺铂耐药高度相关。这也是顺铂对KLE细胞的细胞毒作用不如2-ME的原因之一。2-ME没有改变P-gp 的表达，说明其对此耐药途径没有产生逆转作用。 血管生成对实体肿瘤的生长是必需的，与肿瘤细胞发生浸润和转移关系密切。VEGF是最有效的促血管生成因子。在我们的实验中，随2-ME浓度的增高，VEGF阳性表达率逐渐下降，与对照组相比（无2-ME）差异显著。2-ME 通过对KLE细胞的细胞毒作用，杀灭肿瘤细胞，使之产生的血管生成因子减少，达到抑制血管生成的目的。 在体外实验中，2-ME对子宫内膜癌具有很强的细胞毒作用，其能否在体内也能抑制子宫内膜癌的生长呢？为了评估2-ME体内抗肿瘤和抑制血管生成的功效，制造了一个激素受体阴性的人子宫内膜癌动物模型。治疗组裸鼠每天喂服100mg/kg 的2-ME