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吉林省伯氏疏螺旋体外膜蛋白A基因的克隆和序列分析和DNA疫苗的研制

王峰  
【摘要】:莱姆病发现近30年来,一直在持续蔓延,在美国东北部及北部、欧洲和亚洲地区,莱姆病的病例呈持续上升状况。伯氏疏螺旋体,作为莱姆病的病原体,通过在组织中播散、粘附宿主细胞和逃避免疫清除等机制引发感染。对于控制感染和清除螺旋体来说,免疫反应尤其是巨噬细胞和抗体介导的杀伤效应起到十分重要的作用。适宜这种疾病病原体存在的自然生态环境和难以有效预防的状况,预示莱姆病将成为一个持久的公共健康问题。在20世纪末,莱姆病被认为是一种新法的传染病。在亚洲、美洲和欧洲,莱姆病是目前最常见的节肢动物传播的疾病。例如,自从美国CDC对莱姆病实施监控以来,这类病例不断在增加,到2000年,已经超过了18000例。针对个人的防护,包括防护服、除螨剂和美化居住环境,具有一定的效果。但是在夏季,这些防护手段无法完全实现。 在20世纪90年代,美国研发了重组外膜蛋白A疫苗,结果显示其对预防莱姆病有效并且安全。虽然其中的一种疫苗已经获得上市的资格,但由于一些原因,它并没有被公众和医生广泛接受,并在2002年被生产商撤出了市场。这些原因包括,在大部分地区患莱姆病的几率小,每年或每隔一年需要加强注射,相对于患病早期的抗生素治疗费用,疫苗的费用较高。另外,在一些很少见的病例中,考虑这种疫苗可能触发自身免疫性关节炎的发生。 迄今为止,莱姆病的控制主要依赖与对公众和医生进行教育,包括个人 WP=84 防护、疾病的症状和体征及恰当的抗生素治疗。但是,如果感染的几率持续上升,或人们观念发生改变,疫苗仍然会成为首选。过去10年的经验证实了疫苗预防这种复杂传染病的可能性。 作为一种新发传染病,对于它的流行病学、病原体、临床表现、诊断、治疗和预防等方面,我们并不十分明确。尤其吉林省是莱姆病的自然疫源地,而且近年来,吉林省莱姆病的病例报告数量逐年增加。因此,研究莱姆病的诊断、治疗和预防,对于维护公众健康是极为重要的。国内外学者的大量研究表明,伯氏疏螺旋体外膜蛋白A(OspA)是良好的基因疫苗和诊断试剂的候选者。但是,由于不同地区莱姆病螺旋体分离株外膜蛋白A具有明显的异质性,因此,在美国已经成功上市且对预防莱姆病安全有效的重组外膜蛋白A疫苗,在中国并不能起到预防莱姆病的作用。本研究的目的是调查吉林地区莱姆病螺旋体外膜蛋白A的变异情况,并进行初步的疫苗研制,从而为莱姆病疫苗及诊断试剂的研制提供基础。 在本研究中,我们从2001~2003年在吉林省长白山大峡谷、抚松、朝阳镇等地,采用布旗法捕捉硬蜱,并从这些全沟硬蜱中分离出7株伯氏疏螺旋体(JLcb-1~7)。这七株伯氏疏螺旋体均在BSK培养基中,32°C恒温培养。按常规方法提取DNA。采用多聚酶链反应(PCR)技术从七株分离株的全基因组中扩增OspA基因片断。引物的设计参照美国国家生物技术信息中心的GenBank数据库,检索到伯氏疏螺旋体分离株A14S的外膜蛋白A的核算序列,其注册序列号为AF102057,上、下游引物分别位于18to 40bp 和741 to 762bp处,上游引物为:5'-ggg aat agg tct aat att agc ct -3',下游引物为:5'-agt agt tcc tgc tga gtc gta c-3'。PCR反应条件为:95°C,3分钟,38个循环(94°C 30秒,50°C 30秒,72°C 30秒),72°C 5分钟。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。将扩增产物克隆到pMD-18T载体上,并进行测序。结果显示,捕获的硬蜱均为全沟硬蜱,并证实其带螺旋体率为40.0%。七株螺旋体均扩增出742bp的OspA片断,其核酸序列同源性为97.7%~100%。将其与GenBank中检索的序列(B31,Ya501,10MT,N34, WP=85 TisI,HO14,AR-2,VS116,M53,DN127,VS461,LV5等)进行比较,同源性较低。本研究中7株菌株螺旋体用OspA核酸序列聚类分析方法和其他国外菌株相比具有明显差异,但上述菌株是否属于新的基因型,尚需要进一步研究。 本研究所分离的七株螺旋体均可扩增出742bp的OspA基因,编码247个氨基酸。利用SWISS-MODEL服务器,采用SwissPdbViewer软件对蛋白质的三级结构进行模拟研究。将JLcb1的序列提交给上述服务器,得到JLcb1与数据库中最大同源序列lfjlE、lfjlF、lospO的差异图和JLcb1的三级结构图。初步分析显示:靠近C端中间,从183位氨基酸至223位氨基酸变异较大,考虑能否为抗原决定簇的位置。 本研究将在吉林省新分离到的JLcb1外膜蛋白OspA基因片段克隆到真核表达载体中,构建pCDNA3.1(+)-OspA载体;将pCDNA3.1(+)-OspA载体转染COS7细胞,Western blot检测显示转染细胞中有OspA表达;将pCDNA3.1(+)-OspA作为DNA疫苗免疫C57小鼠,ELISA方法在小鼠的血清中检测到特异性抗体,初步动物免疫实验说明OspA具有良好的抗原性。 总之,本研究第一次阐述了吉林地区莱姆病伯氏疏螺旋体外膜蛋白A的特征。根据目前研究,其外膜蛋白A与其它在GenBank数据库中检索到的螺旋体分离株的OspA核酸序列具有明显差异,将其纳入哪一种基因型尚有待于进一步研究,为针对我省情况研发疫苗和诊断试剂打下了良好的基础。下一步研究,应从宿主动物和病人中提取病原体,并进行这些病原体的外膜蛋白A的变异情况的研究,这样能更深入的阐述伯氏


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