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长春新碱对实验性糖尿病肾病大鼠治疗作用及机制的研究

屈智慧  
【摘要】:糖尿病肾病(DN)是糖尿病最严重微血管的并发症之一,临床特点是大量蛋白尿,其病理学特征是早期细胞周期调控异常导致肾脏肥大,基底膜增厚,细胞外基质增多,进而系膜区增宽,最后发展为肾小球硬化。DN复杂的发病机制中,较为重要的是转化生长因子β1(TGF-β1)与nephrin蛋白。TGF-β1通过自分泌与旁分泌途径,诱导肾小球及肾小管细胞肥大,促进ECM合成,抑制基质金属蛋白酶(MMP)的表达与活化,阻碍细胞外基质(ECM)的降解,直接导致肾脏肥大以及肾小球基底膜增厚(GBM)和系膜区扩张等DN组织形态学改变;Nephrin是肾小球裂滤过屏障的重要成分,在维持肾小球裂孔膜结构与功能完整性方面有不容忽视的作用,其分布与表达量的异常可以影响尿蛋白的漏出。 实验性糖尿病动物模型有很多种,本研究选择用STZ诱导Wistar大鼠的1型糖尿病动物模型。其优点是来源广泛易得、造模方法简单、成功率高以及可控性好、费用低廉等。STZ通过选择性损伤胰岛β细胞导致糖尿病,注射后大鼠尿蛋白增加,肾重/体重有增高趋势,同时形态学改变亦符合人类DN早期特征。 DN的治疗目前缺乏有效的方法。长春新碱(VCR)属细胞周期特异性药物, 能抑制细胞的增殖,临床主要用于肿瘤治疗。但有报道VCR治疗小儿难治性肾 病综合征取得了较好的疗效,由此考虑,VCR可能对部分肾脏疾病的蛋白尿有 治疗作用;同时,在ON早期存在细胞周期调控异常,而VCR属细胞周期特异 性药物,基于此原理,本研究将VCR用于ON的治疗并探讨其作用机理。 本实验运用生化学、形态学、免疫组织化学、Western blot以及RT-PCR 等分子生物学技术,重点研究了VCR对ON大鼠模型的治疗作用,包括VCR 对ON大鼠尿蛋白的作用、对ON大鼠肾脏组织形态学的改善情况以及对细胞 因子TGF一pl和nephrin蛋白表达的影响,旨在探讨VCR对ON的治疗作用及 其生物学机制。 本研究的主要结果如下: 1.STZ注射后,生化学分析结果表明,大鼠血糖增高,4周后尿蛋白增加,12 周时肾重/体重有增高趋势,病理形态学研究显示:光镜下大鼠肾脏的ECM增 多,系膜细胞增生,同时毛细血管部分塌陷,系膜区PAS阳性物质增多;电镜 下部分基底膜呈不规则节段性增厚,上皮细胞足突广泛融合,上述特点与人类 ON的特征相似。 2.在ON模型中,TGF一pl的检测结果表明:免疫组化染色半定量分析提示 TGF一pl表达分布于肾小球系膜区,肾小管上皮细胞及间质也有表达,阳性颗 粒主要位于胞浆中。丁GF一p,表达量明显增加,染色强度明显强于正常组,在 ECM积聚部位更明显;R下pCR结果提示:ON大鼠肾皮质丁GF一日,mRNA表 达较正常大鼠明显增加,这与免疫组化的结果相一致。说明下G卜p,参与ON 的发生,是ON的重要发病机制之一。 3.在ON模型中,nephrin的检测结果表明:免疫组化染色分析提示ON大鼠 肾组织nephrin表达分布于肾小球,沿肾小球毛细血管拌分布,但较正常大鼠 分布不均匀;Western blot结果提示:ON大鼠肾皮质nephrin蛋白表达较正常 大鼠微弱,说明ON大鼠nephrin蛋白表达降低,考虑nephrin是ON发病的 另一重要机制。 4.VCR治疗的ON大鼠尿蛋白的排泄量降低,病理形态学研究显示:VCR能 够部分减轻ON大鼠肾脏细胞外基质积聚,减轻肾脏肥大,说明VCR对ON存 在一定治疗作用。 5.VCR治疗的ON大鼠,TGF一p,免疫组化染色分析提示VCR能够减轻 ON大鼠肾脏组织TGF一pl的染色强度,这从某一角度阐述了VCR治疗ON 的可行性;RT-户CR结果提示:经过VCR治疗后,TGF一日1 mRNA表达有所下 降,从而我们可以推论VCR能够降低ON大鼠肾组织中TGF一p 1 mRNA表达是 VCR治疗ON的机制之一。 6.VCR治疗的DN大鼠,Western blot结果提示:经过VCR治疗的大鼠, 其肾脏皮质nephrin蛋白的表达较ON大鼠有所提高,推断是这是VCR治疗 ON的另一重要机制。 本研究的主要结论是: 1.WIStar大鼠腹腔内注射S丁Z,可诱发实验性糖尿病,4周后其病理和生物化 学改变与人类ON相似。 乡乙 2.VCR能够在一定程度上减低ON大鼠尿蛋白的排泄,这与VCR增加nephrin 蛋白的表达有关。 3.ON大鼠肾重/体重指数较正常大鼠高,说明ON早期存在肾脏肥大。 4.VCR能够减轻ON大鼠肾脏细胞外基质积聚,减轻肾脏肥大,这与VCR降 低ON大鼠肾脏皮质TGF一pl表达有关。 5.VCR对ON大鼠有一定的治疗作用,其作用机制与VCR影响ON大鼠肾脏 皮质TGF一pl以及nePhrin的表达有关。 这些研究结果为长春新碱治疗糖尿病肾病的可行性分析及作用机制提供了 实验室依据。 本研究的创新之处在于:首次将长春新碱用于糖尿病肾病的治疗,并从生 物化学、病理形态学、分子生物学角度探讨其治疗效果与作用机制,为将来糖 尿病肾病的细胞周期治疗提供了实验室依据。


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