肿瘤细胞向血管外游走过程中内皮细胞功能调控的研究

【摘要】：肿瘤细胞的血行转移是一个复杂的生物学过程，要经过以下几个环节:①原发灶肿瘤细胞的增殖及游离；②肿瘤细胞浸润血管基底膜、游走至血管内；③与转移部位血管内皮细胞粘附，并穿过血管内皮细胞、游走至血管外；④转移至目标脏器并增殖。其中肿瘤细胞的血管外游走是血行转移的关键环节，是肿瘤细胞与血管内皮细胞相互作用的过程。 进入血液循环的肿瘤细胞首先粘附在靶器官的血管内皮细胞表面，这是游走至血管外的前提。肿瘤细胞与血管内皮细胞粘附后引起的细胞信号转导过程及通过何种途径游走至血管外的，目前尚不完全清楚。曾有人提出肿瘤细胞是通过内皮细胞的胞饮作用游走至血管外的。有研究指出：肿瘤细胞的转移与炎症时中性粒细胞的浸润过程相类似，而炎症时中性粒细胞是通过内皮细胞间缝隙游走至血管外的。我们认为可以通过炎症时中性粒细胞以及巨噬细胞等的浸润机制来推测肿瘤细胞的血管外游走过程。基于目前研究现状，我们建立了肿瘤细胞向血管外游走模型，并利用该模型来探讨肿瘤 WP=91 细胞的血管外游走途径及内皮细胞的功能调控机制。 我们建立肿瘤细胞向血管外游走的体外模型，即在胶原凝胶层上培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell HUVEC）单细胞层，因为胶原是血管外基质的主要成分，这样即可在体外模拟构建单层血管内皮及血管外基质，然后在HUVEC单细胞层表面加入肿瘤细胞，形成肿瘤细胞侵袭血管内皮的状态。形成充分融合的血管内皮单细胞层是建立模型中最关键的步骤，我们使用吉姆萨染色和测量HUVEC单细胞层电阻等方法确保形成充分融合的HUVEC单细胞层。建立肿瘤细胞向血管外游走的体外模型后，观察肿瘤细胞的血管外游走状况，发现肿瘤细胞能够穿过内皮细胞游走至血管外，具有时间依赖性。并在多种肿瘤细胞中筛选出适合实验的、高侵袭力的肿瘤细胞---纤维肉瘤细胞(HT1080)。 为了解肿瘤细胞向血管外游走途径及游走过程与血管内皮通透性的关系，我们测定了HT1080游走过程中HUVEC单细胞层的电阻变化，因为HUVEC单细胞层的电阻变化可以用来定量说明血管内皮通透性的改变。发现HT1080向血管外游走过程中HUVEC单细胞层跨膜电阻迅速下降，这说明肿瘤细胞的血管外游走能够迅速增加血管内皮通透性。而血管内皮通透性的增加是由内皮细胞收缩、细胞间缝隙加大引起的，也就证实了肿瘤细胞向血管外游走是通过内皮细胞间缝隙进行的。 细胞间缝隙加大意味着细胞间连接发生改变，内皮细胞间连接主要为紧密连接和粘附连接，它们与细胞骨架蛋白，特别是F-肌动蛋白关系密切。因此我们对HUVEC单细胞层进行了F-肌动蛋白免疫荧光染色，发现正常状态下内皮细胞F-肌动蛋白随机的、无方向性的分布在靠近细胞边缘的细胞质中；在内皮细胞表面加入HT1080后，内皮细胞F-肌动蛋白出现再分布重排，聚集成网。说明了HT1080 WP=92 向血管外游走过程与HUVEC内的F-肌动蛋白的再分布重排密切相关，正是由于F-肌动蛋白的上述变化，才引起了HUVEC收缩、细胞间缝隙加大。 研究证实：F-肌动蛋白骨架产生的中心张力是调节内皮通透性的直接动力，来源于肌球蛋白轻链（myosin light chain MLC）磷酸化介导的肌动-肌球蛋白间相互作用。为阐明内皮细胞F-肌动蛋白在肿瘤细胞游走过程中的再分布重排机制，我们利用细胞内磷酸化实验、放射自显影技术测定了HT1080游走过程中HUVEC MLC磷酸化水平的变化，发现随着HT1080游走时间的延长（30min--3h），HUVEC的MLC磷酸化水平逐渐升高；因为已知MLC磷酸化部位在19位的丝氨酸残基（Ser19），所以我们进一步使用抗P-Ser抗体进行Western blot，发现随着HT1080游走时间的延长（30min--3h），HUVEC的MLC丝氨酸磷酸化水平逐渐升高，说明HT1080的血管外游走过程与HUVEC的MLC磷酸化密切相关。正是由于游走过程中HUVEC的MLC磷酸化水平升高，诱导F-肌动蛋白出现上述变化，才促使HT1080通过HUVEC间缝隙游走至血管外。表明了肿瘤细胞的血管外游走过程是由内皮细胞MLC磷酸化所介导的。 研究已证实肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase MLCK）以及Rho/Rho激酶作为信号传递介质在细胞信号转导中起到重要作用。MLCK是一种Ca2+/CaM依赖性的激酶，在Ca2+介导的信号转导中起重要作用，通过升高细胞内MLC的磷酸化水平，诱导肌球蛋白和肌动蛋白之间的相互作用，调控细胞收缩。Rho作为受体-G蛋白偶联中的信号传递物质，可以激活其底物Rho激酶，通过抑制MLC磷酸酶的活性来调节MLC的磷酸化水平，是联系细胞膜表面受体与肌动蛋白细胞骨架的关键调节分子。为阐明MLCK以及Rho/Rho激酶在肿瘤细胞向血管外游走过程中的作用，我们在实验中使用了MLCK及Rho/Rho激酶抑制剂对HUVEC单细胞层进行预处理，发现能 WP=93 够有意义的抑制HT1080的血管外游走过程和HT1080游走引起的HUVEC单细胞层的电阻下降；还能明显抑制HT1080的血管外游走过程中出现的HUVEC内F-肌动蛋白的重排再分布、聚集以及游走过程中HUVEC MLC磷酸化水平的升高。这说明MLCK以及Rho/Rho激酶对肿瘤细胞血管外游走过程具有很强的调控作用，而这种调控作用是通过调节MLC磷酸化水平实现的。也说明