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含硒单链抗体酶的人源化

林凤  
【摘要】:需氧生物在利用氧的过程中,会产生对机体有害的活性氧(ROS),在正常情况下,机体ROS的产生和清除处于平衡状态,但在某些情况下,ROS的产生和清除不平衡时,过多ROS会损伤机体的各种生物大分子,如RNA、DNA、蛋白质、糖类和脂类,从而导致细胞功能紊乱。为了清除ROS对机体的损伤,机体建立了一系列防御系统,主要包括酶学和非酶学抗氧化体系。酶学体系由超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和过氧化氢酶(CAT)等组成:非酶学体系包括一些抗氧化小分子,如α-生育酚、抗坏血酸(Vc)和还原型谷胱甘肽(GSH)等。GPX在机体抗氧化体系中起着十分重要的作用,它不仅能清除脂类氢过氧化物(ROOH),并在过氧化氢酶(CAT)含量很少或过氧化氢(H_2O_2)产量很低的组织中,可代替CAT清除H_2O_2,所以GPX有防止畸变,预防衰老及参与前列腺素合成等重要生理作用。人体若缺乏GPX会导致由于H_2O_2损伤而引起的一系列疾病,如各种炎症、结肠癌、心脑血管疾病、生理性衰老等,因此,研究及开发GPX对酶催化机理的探索和疾病预防具有重大意义。由于天然GPX分子量大,不易纯化,半衰期短以及难于用基因工程方法获得等不利因素,严重限制了其应用。如何生产高GPX活力的模拟物是摆在生物学家面前的一个难题,各国科学家纷纷研制GPX的模拟物,其中比较著名的GPX模拟物为Ebselen(2-苯基-1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮),在日本它已经进入Ⅲ期临床阶段,但由于GPX活力只有0.99U/μmol,并且水溶性差,导致其应用受到了有一定的限制。在近几年中,我们实验室制各并合成了一系列具有GPX活力鼠源抗体酶,并且在动物模型中表现出很好的抗氧化活性,但由于鼠源抗体应用于人体会存在严重的人—抗 中文摘要 ..叫,....甲....... 鼠反应(HAMA),所以抗体酶人源化势在必行。2001年,丁兰小组成功从 人源化半合成噬菌体抗体库中筛选出具有GPX结合活性的单链抗体,并在大 肠杆菌中表达、纯化,但遗憾的是当用化学诱变法引入催化基团一硒代半耽 氨酸(Sec)时,其GPX活力仅为80U/帅of,同普通的免疫球蛋白(I gG)分 子硒化后的GPX活力71 .4U/娜of基本相同,所以制备人源化的高GPX活力 抗体酶是巨大的挑战。 本文首次改造己有的经化学诱变后具有高GPX活力的鼠源单链抗体,并 展示于噬菌粒pFUW一80表面,设计半抗原,通过亲和筛选获得对半抗原特异 结合的单链抗体,在大肠杆菌Rosetta中成功表达。经纯化后的单链抗体通过 化学法引入催化基团一Sec,其GpX活力为88OU/卿ol,是第一个人源化GPX 抗体酶高11倍,这种高GPX活力的人源化抗体酶作为抗氧化剂具有广阔的 应用前景。 1、构建人源化噬菌体展示抗体库 对鼠源单链抗体的改形分重链和轻链两部分。在蛋白质数据库(PDB) 中,通过同源序列分析分别确定与重链和轻链同源性较高的人源抗体,对于 鼠源单链抗体的改造,除了完全保留CDR区外,还通过计算机模拟的抗原结 合位点的空间结构,确定与CDR结构在空间上有关的氨基酸残基,并与人同 源抗体该部位的氨基酸同时成对保留,形成人源化轻、重链抗体库。重链采 取分段全序列合成的方法连接而成,轻链则通过重迭 PCR方法扩增而成,用 连接肤(Gl外Ser)3把轻、重链连接起来,并克隆于噬菌粒载体pFUW一80中, 通过辅助噬菌体M13K07使人源化单链抗体展示于噬菌粒pFUw一80表面。 构建的抗体库的理论库容为连接产物转化后在有氨节抗性平板上的菌落数, 而实际库容为理论库容XPCR可扩增出单链抗体的比例。 2、具有GPX结合活性的单链抗体的筛选 用疏水腔修饰法,设计并合成半抗原GSH一S一DNP一Bu和GSH一S一DNP一Me, 进行抗体库的筛选。以噬菌体单链为模板进行PCR扩增,用BstNI酶切扩增 的单链抗体基因,通过DNA指纹法验证了单链抗体库的多样性,ELISA法验 证了筛选的阳性克隆。经4轮筛选,分别得到了对半抗原特异性结合的单链 抗体,从ELISA结果选出Bg和B14对GSH一S一DNP.Bu特异结合的抗体,通 中文摘要 过双酶切法和DNA序列分析法进行阳性鉴定。 3、定向进化构建次级库及特异结合性抗体的筛选 如何获得高亲和力抗体始终是噬菌体抗体库技术的一个发展方向。由于 构建的人源化抗体库库容较小,我们采用DNA改组技术在体外提高抗体的亲 和力,即通过有性和无性PCR扩增出特异性单链抗体基因后克隆于噬菌粒载 体pFUW一80中,形成次级抗体库,以GSH一s~DN甲一Bu为半抗原,进行正向有 意义突变的高亲和性抗体的筛选。经过3轮筛选后筛选出的单链抗体的ELISA 信号明显高于DNA改组前的两个阳性克隆,我们选ELISA信号最强的噬菌 体抗体克隆BS进行以后的表达。 4、单链抗体在大肠杆菌的表达及纯化 通过PCR扩增出单链抗体BS基因,然后克隆于载体pPe扭中,通过双 酶切法和DNA序列分析法鉴定连接产物,证实单链抗体基因已按正确方向连 入表达载体中。通过对表达菌株进行优化选择了最佳表达菌株,然后对诱导 剂加入时菌体浓度、诱导剂浓度和诱导表达时间进行优化,得到适合单链抗 体表达的最优条件,按此条件大量表达目的蛋白。通过Ni2+金属离子鳌合纯 化目的


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