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肠出血性及产志贺样毒素大肠埃希菌耐药机制的研究

李咏梅  
【摘要】:肠出血性大肠埃希菌(enterohemorrhagic Ecoli,EHEC)被认为是出血性结肠炎的重要病原因子。感染此菌后可引起各种各样的临床表现如水样腹泻、出血性结肠炎,并导致严重的并发症,溶血性尿毒综合征(hemorrhagic uremic syndrome, HUS);血小板减少性紫癜(TTP)。EHEC的主要血清型是O157:H7,也是世界范围内重要的食源性致病菌,但是其他血清型如O111、O26、O103等也与HC的散发病例有关。 EHEC致病主要通过stx基因编码的Stx1和Stx2毒素,因此这类细菌也被称为产志贺样毒素大肠埃希菌(Shiga-toxin producing Ecoli,STEC)。另外也靠位于LEE毒力岛上的eaeA基因编码紧密素;hlyA基因编码的溶血毒素致病。STEC通常定居于家畜的肠道中,被认为是无数食物中毒暴发流行的祸源。主要通过食品加工不彻底、屠宰过程中肉类污染、以及食用生牛奶等制品而感染人类。在治疗此类感染性疾病的过程中,原则上不提倡使用抗生素,因为有资料表明抗生素可促使细菌释放Stx而使疾病进展成HUS。可是人们往往在疾病确诊之前,在无细菌学支持的情况下盲目使用抗生素来控制病情。很有可能使抗生素耐药性菌株在此压力环境下被选择出来。许多学者也从细胞膜通透性、产生灭活酶、流出泵等多方面对细菌耐药机制进行了相关报道,但都很难清楚地对细菌耐药性的产生及其机制加以解释。最近又有相关文献报道,认为有一种新的可移动性基因系统即基因盒-整合子系统(gene cassette-integrons system)与耐药性的产生和传播有着密切的关系。 吉林大学博士学位论文 整合子是一个具有捕获外源基因能力,并使之转变为功能性基因的表达 单位,是运动性的DNA分子。主要见于革兰阴性杆菌,以肠杆菌、铜绿假 单胞菌为多见(阳性菌最近也有报道),是革兰阴性杆菌多重耐药性迅速发 展的主要原因。整合子定位于染色体及具有广泛宿主的质粒或转座子上,包 含两个保守的DNA片段,两片段的中央区是长度和序列可变的片段,可插 入编码某种功能的基因,如耐药基因,被称为插入盒(Inserted。assette),亦 称基因盒(cassette)。目前对基因盒一整合子系统在EHEC和STEC细菌中的 产生和传播机制知之甚少。因此,本项目从EHEC、STEC的分子鉴定入手, 进行耐药性整合子在不同地域菌株中耐药性的产生和传播机制的研究,旨在 了解抗生素耐药整合子在此类致病菌中的产生、分布和传播,并阐明整合子 基因盒对细菌耐药性的形成与抗生素压力选择的相互关系及介导细菌多重 耐药性的机制。 本研究首先使用常规方法从112份各种标本中分离鉴定出76株大肠埃 希菌,然后用stxl、stxZ、eaeA、hiyA基因的特异性引物,经PCR扩增鉴定 出产志贺样毒素及兼有其他毒力因子的菌株18株,并用诊断血清分型为 0157(l)和非0157(17)两大群。最终用于后续试验的共有48株,包括 来自美国的20株,其中STEC:非STEC为18:2,14株为0157型;中国流 行病研究所提供的10株,均为 0157型产志贺样毒素菌株。 采用WHO推荐的K一B法,用常用的18种抗生素对来自两地的菌株进 行耐药性监测,结果显示:在耐药性上除对红霉素(美国95%;中国60.7%)、 氨节西林(美国30%;中国60.7%)和庆大霉素(美国30%;中国143%) 有差别外P0.01,其他类抗生素则基本上一致,尤其是对磺胺类药物的耐 药率均为100%。但两地菌株几乎同时对氯霉素、吠喃妥因敏感。表明与国 内外人类和动物分别大量和较少使用前述抗生素有关。非0157型STEC的 耐药总菌次(112)高于0157型STEC(62),提示可能与确诊的病例不提 存了犷 丫 吉林大学博士学位论文 倡使用抗生素治疗0157感染有关。间接说明耐药性的产生与抗生素选择压 力相关。 利用特异性引物,经PCR法从试验菌株中扩增鉴定出1类整合子n株 (美国2/10,中国9/28)。11株中人源5(5/17);动物或食品4(4/20);环 境为2(2/11)。所有整合子阳性株整合酶基因、Sul基因阳性,所有菌株均 不含有2类整合子。结果显示:中国分离株的1类整合子含有率(33.1%) 明显高于美国分离株(10%)P0.05。而且整合子阳性菌株均为至少耐3种 抗生素的多重耐药菌株,甚至有6株对5种以上抗生素耐药,均来自国内分 离株。说明与国内大量和无细菌学支持下盲目使用抗生素有关,也与食用性 动物饲料中添加某些抗生素提高产量有关,此举无疑增加了抗生素的选择压 力。 整合子的PCR产物纯化后测序,并登录Gen一Bank,经BLAST分析结 果显示:有9株含有aadAI基因盒,有2株含有aadAZ基因盒,均决定着对 氨基糖昔类抗生素的耐药性。尽管基因盒类型单一,但其具有完整的基因盒 一整合子结构,表明有整合、重组其他基因盒的物质基础和潜能。 为了明确整合子的基因定位和细菌耐药性迅速蔓延的机制,本研究以 PCR法钓取整合酶基因,并用H即标记为杂交探针,然后与整合子阳性菌 株的染色体、质粒DNA进行杂交。结果表明:鉴定出的1类整合子均定位 于细菌质粒。通过转化和接合试验证实耐药整合子可随细菌质粒在同种菌属 细菌之间、异种菌属细菌之间转移和扩散;说明细菌的耐药整合子可通过接 合性和非接合性传播途径在同


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