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PPAR-γ激活对糖基化终末产物引起的大鼠肾脏纤溶酶原激活物抑制物-1上调的影响

于晓艳  
【摘要】:糖尿病肾病的基本病变是肾小球细胞外基质(ECM)积聚,ECM的量是由合成和降解两个过程调节的,研究证明ECM降解减少也是导致ECM积聚的重要环节。肾脏内主要存在两类蛋白酶系统:纤溶系统与基质金属蛋白酶系统(MMPs)。纤溶系统主要包括纤溶酶原(plasminogen)、纤溶酶(plasmin)、纤溶酶原激活物(PA)与其抑制物(PAI)。纤溶系统不仅在维持血液凝血及纤溶平衡中起作用,而且参与细胞外基质的降解。PAI-1作为纤溶酶原激活物的主要抑制物,调节纤溶过程及纤溶酶介导的MMPs激活。研究表明,糖尿病大鼠肾皮质PAl.1活性明显升高,tPA活性下降,PAl.1 mRNA表达显著增加。 糖基化终末产物(AGEs)在糖尿病肾病等慢性并发症的发病机制中起 重要作用。正常大鼠给予外源性AGEs能造成肾小球肥大、系膜硬化、基 质蛋白基因表达增加,引起类似人类糖尿病肾病的病变。我们以前的研究 发现,AGEs可降低肾小球基质金属蛋白酶.2(MMP-2)的活性和表达,至于AGEs对PA/PAI的影响尚无系统研究。 过氧化物酶体增殖体激活受体(PPAR.)是一种新的治疗肾脏疾病的靶 点。它是依赖配体的转录生长因子,是核激素受体超家族的成员。PPARs 通过对转录水平的调控影响多种细胞过程,包括脂代谢、糖代谢平衡、细 WP=85 胞周期、细胞分化,炎症和细胞外基质重建等。在肾脏PPAR的三种形式 均不同程度地表达,系膜细胞主要表达PPAR-Y。抗糖尿病药物四氢噻唑 烷二酮类药物(TZDs,),如曲格列酮(troglitazone),罗格列酮(rosiglitazone)是PPAR—Y的特异配体。在STZ诱导的糖尿病大鼠给予抗糖尿病剂量的曲格列酮(激活PPAR-Y),在三个月内降低尿白蛋白排泄率,治疗的同时降低肾小球PAl-1表达,提示PPARr激活可直接改善糖尿病肾脏改变,其机制可能是通过抑制PAI-1的表达,减轻对纤溶酶及MMP-2的抑制,从而改善细胞外基质的降解。 本研究采用正常大鼠体内注射AGEs及体外肾系膜细胞培养。在体内 实验中将大鼠分为5组:正常对照组,单纯血清组(正常大鼠血清100 mg/kg),AGEs组(AGEs 100 mg/kg),氨基胍组(AGEs 100 mg/kg+.AG 40 mg/kg)及罗格列酮组(AGEs 100 mgg+罗格列酮2mg/kg)。体外实验检测不同浓度、不同时间AGEs(糖化牛血清白蛋白)对系膜细胞的影响, 以BSA(牛血清白蛋白)作为对照。检测技术包括有生化自动分析、RT-PCR、Western Blot、形态学检测、免疫组织化学、ELISA和酶谱分析等。重点研究以下几个问题:(1)AGEs对大鼠肾脏PAI-1活性和表达的影响。(2)AGEs对大鼠系膜细胞PAI-1活性和表达的影响。(3)给予PPAR-γ激活剂能否缓解AGEs对PAI-1的影响。通过这些研究探讨AGEs、PPAR-γ的作用机制,为糖尿病肾病的防治提供理论依据。 研究主要结果如下: 一、AGEs于肾小球及系膜细胞结构和功能的影响 与单纯血清组比较,尿蛋白排泄率明显增高(P0.01),肾小球PAS 染色阳性物质沉着区明显增大,肾小球及小管FN和IV型胶原的含量增加, 电镜下肾小球基膜呈不规则节段性增厚,足突明显融合,系膜区扩大。同 时给予AGEs形成抑制剂氨基胍的大鼠上述形态改变明显减轻,血肌酐水 WP=86 平明显降低(P0.05),尿蛋白排泄率也明显降低(PO.05)。 AGEs(0~200kg/m1)对系膜细胞增殖虽无明显作用,但能明显增加系膜细胞条件培养基中FN、Ⅳ胶原蛋白的含量。与相应浓度的BSA比较, 12.5~200kg/ml AGEs可明显刺激系膜细胞FN的生成,100~200kg/ml AGEs能明显刺激系膜细胞Ⅳ胶原的生成。AGEs(100~kg/m1)对系膜细胞条件培养基FN、IV胶原含量的影响均随着时间的增加有所提高。 二、AGEs对肾小球及系膜细胞PAl表达和活性的影响 与阴性对照组比较,AGEs组大鼠肾皮质PAl-1 mRNA及蛋白表达均 明显升高,而PA活性明显降低。给予氨基胍后这些改变明显减轻。与相应浓度的BSA组比较,AGEs组(0~200kg/ml)系膜细胞PAl-1蛋白含量明显增加;AGEs浓度为0~50kg/ml时PAl-1蛋白含量随AGEs浓度增加而增加,50~200靏/ml时到达平台期。AGEs(100~kg/m1)能促进PAl-1 mRNA表达明显增高(p0.01)。这些结果表明AGEs能促进PAI-1的表达,并且在一定浓度范围内(O~50kg/m1)为浓度依赖性。AGEs浓度为0~100kg/ml时,系膜细胞条件培养基中FN、IV胶原的含量与PAI 的变化较为一致,AGEs浓度范围100~200 kg/m1时,PAl含量不再增高而FN、IV胶原继续升高。提示AGEs引起的细胞外基质增加与PAI-1抑制降解有关,当PAl-1含量不再升高时,引起的FN、IV胶原含量增高可能有其他因素参与,如合成增加或降解酶活性降低。 三、AGEs对PPAR-γ表达的影响 本实验发现,在体PbAGEs能促进系膜细胞PPAR-γ mRNA表达,而在 整体动物给予AGEs后未见肾皮质PPAR-γ mRNA和蛋白质表达增加,免疫 组化显示给AGES后虽然肾脏总体PPAR-γ蛋白阳性颗粒降低,但肾小球内未见PPAR-γ蛋白表达明显降低,这种结果可能由于肾皮质包含多种细胞成分,提示AGEs对肾内不同细胞的作用可能不同。 WP=87 PPAR-γ激活剂的肾脏保护作用 与AGEs组比较,罗格列酮组大鼠尿蛋白排泄率明显降低(P0.05


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