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急性脊髓损伤脊髓和脑脊液的蛋白质组学研究

臧虎  
【摘要】:在人类基因组草图完成的后基因组时代,蛋白质组学作为功能基因组研究的重要组成部分方兴正艾。蛋白质组学(Proteomics)的出现,特别是功能蛋白质组学的提出为揭示疾病的分子机制提供了良好的平台。功能蛋白质组学能够从整体方面定量分析生理状态下同一组织、细胞在不同发育阶段以及病理情况下同一疾病的不同发展阶段的蛋白质表达模式和功能模式的变化,揭示一些重大疾病的发生发展规律。 脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是一种严重的神经系统创伤,,是骨科领域的常见创伤。急性脊髓损伤和修复的机制十分复杂,传统方法如:免疫组化、免疫印迹法和流式细胞仪间接免疫荧光技术只能检测一种或几种蛋白质的表达,信息量有限,不能整体水平反映脊髓损伤后蛋白质作用机理。蛋白质组学提供了从动态、整体的角度,在蛋白质水平上探讨脊髓损伤机理了新的有效手段。 有关急性脊髓损伤蛋白质组学研究尚未见报道。开展脊髓损伤修复与预后蛋白质组研究,动态、定量、全方位地观察急性脊髓损伤修复与预后发生发展过程中蛋白质种类、数量的改变,有助于发现脊髓损伤特异的、敏感寻找生物标记,即疾病特异性蛋白(disease specific proteins,DSPs);研究脊髓损伤后基因产物的合成率、降解率、功能完成、翻译后修饰程度、亚细胞水平的分布以及与其它细胞成分的相互作用等 WP=104 具有极其重要意义,也是从分子水平进一步阐明脊髓损伤发病机理的重要途径。 本实验目的:建立和优化脊髓、脑脊液蛋白质组分析的双向电泳的技术;建立正常和损伤脊髓,脑脊液蛋白质组双向凝胶电泳图谱。比较急性脊髓损伤后脊髓、脑脊液蛋白质组表达谱变化。筛选出影响脊髓损伤和修复的特异性蛋白质,为从蛋白质分子水平揭示急性脊髓损伤及修复机制打下基础。 本研究首先利用改良Allen法建立急性脊髓损伤动物模型,并于损伤后24小时采集脊髓标本,同时在临床抽取脊髓损伤病人脑脊液;然后利用固相pH梯度双向电泳(IPG-2-DE)分离急性脊髓后脊髓和脑脊液的总蛋白质,凝胶银染显色,建立双向电泳图谱。应用PD-Quest软件图象分析,选取部分差异表达的蛋白质,应用LCQ-DECA XPplus(液相色谱-电喷雾串联质谱)分析获得肽分子重量和肽序列标签,SEQUEST软件对从NCBInr数据库鉴定蛋白质。 本研究通过对原有双向凝胶电泳技术进行优化获得了分辨率和重复性较好的脊髓损伤后脊髓和脑脊液的双向凝胶电泳图谱。其中家兔脊髓正常对照组、脊髓损伤24小时组分别检测到(413±32)和(367±29)个蛋白质点,蛋白质斑点匹配率平均分别是85%和83%。筛选出差异蛋白质点40个,在脊髓损伤组织图谱中新增6个蛋白质点、19蛋白质点含量增加;另有11蛋白质点减弱,4个蛋白质点消失。而在正常对照组、脊髓损伤24小时组脑脊液分别检测到(131±10)和(144±16)个蛋白质点,筛选出差异蛋白质点25个。在脊髓损伤脑脊液图谱中新增7个蛋白质点、6个蛋白质点含量增加;7个蛋白质点减弱,5个蛋白质点消失。在家兔脊髓组织电泳胶上选择明显差异的12个蛋白点斑点,进行LCQ-DECA XPplus质谱分析,数据库查询,得到9个相应的蛋白质。新出现的蛋白有Endooligopeptidase A related protein,hypothetical 152.1kDa protein;消失 WP=105 的有Calpain inhibitor,Hypothetical protein cgi-10;升高的Neurofilament triplet Mprotein,Nerve growth fator、Calpain;降低的有α1-Acid-glycoprotein、Oxygen regulated protein 1。同时在人脑脊液电泳胶上选取有明显差异的10个蛋白点斑点,进行质谱分析,得到7个蛋白质。脊髓损伤后新出现的蛋白有Myelin basic protein Ⅱ消失的有transferrin precusor;升高的Insulin-like growth factor I precursor、PRR2-alpha-humanⅡ、MIST;降低的有α-2-HS glycoprotein 、hypothetical protein FLJ20309。 本研究在Allen法基础上,采用自制击打器建立了不同程度急性脊髓损伤动物模型,经行为学评定和组织学观察,证实该脊髓分级损伤的模型操作技术简便,重复性较好,可以造成与临床相近的损伤,为科研提供了比较可靠的实验模型。本研究还在原有技术基础上,以IPG等电聚焦为第一向、垂直SDS PAGE为第二向 ,对脊髓蛋白质样品提取、等电聚焦上样量、等电聚焦电泳参数、SDS PAGE、SDS胶染色及保存进行了研究和实验条件优化,建立和优化了脊髓、脑脊液蛋白质组分析的双向电泳的技术。本实验在国内首先成功建立了正常和损伤脊髓,脑脊液蛋白质组双向电泳图谱,该图谱能够从蛋白质水平上直接反映脊髓损伤所引发的脊髓蛋白质组变化的全貌。并识别和鉴定出部分差异表达的蛋白质,为阐明急性脊髓损伤后损伤和修复的机制奠立了初步基础,提供了实验依据。


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