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双价肾综合征出血热纯化疫苗(Vero 细胞)的研究

卢日峰  
【摘要】:肾综合征出血热是主要由携带汉坦病毒的鼠类传播引起的一种自然疫源性疾病,是十余种病毒性出血热中在世界上分布最广、发病数最多、危害性最大的一种。尤其在我国,姬鼠型和家鼠型两种亚型的肾综合征出血热每年都有流行,是除了病毒性肝炎以外危害性最大的一种恶性传染病。该病于本世纪30年代起在欧亚大陆国家陆续被发现,1942年确定为流行性出血热,1994年由卫生部发文改称为肾综合征出血热。 我国已发现67种脊椎动物自然感染汉坦病毒,其中主要宿主和传染源有黑线姬鼠和褐家鼠以及实验用大白鼠等多种鼠类,鸟类、家养动物如家猫、家猪等在一定条件下也能起着扩大传播汉坦病毒的作用。目前已知的汉坦病毒的传播途径有:动物源性、螨媒和垂直传播。 肾综合征出血热病毒具有侵犯宿主多种器官的泛嗜性和病变累积全身各系统的特点,临床表现复杂。具体病例具有三大主症,即发热、出血和肾脏损害,其最显著的症状为“三红”,即患者的颜面部、颈部、前胸充血潮红,“三痛”,即眼眶痛、头痛、腰痛,并依次出现五期过程,即发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期。重症病例病情重,来势凶猛,病期可相互重叠,预后较差。除了主要症状外,有多种异型临床表现,如肺出血型、脑膜炎型等,容易造成误诊,延误治疗。 1950-1995年肾综合征出血热在全球发病130万例,到2000年全球发病例数已经超过162万,其中中国145万例,占全球发病数的90%以上,病死 WP=89 率平均2.02%,由于该病预后差,严重者将丧失重体力劳动能力。因此国家将该病列为重点控制的疾病。 疫苗接种是预防肾综合征出血热最有效的办法。最早的疫苗研究开始于二十世纪七十年代末,到1993年国内已经成功研制了三种出血热灭活疫苗,即沙鼠肾细胞I型疫苗、地鼠肾细胞II型疫苗和乳鼠脑纯化疫苗,上述三种疫苗是将出血热病毒适应株毒种悬液接种于原代细胞,病毒培养后破碎细胞使病毒溶解于上清中,去除细胞碎片,加入灭活剂(β-丙内酯或福尔马林)灭活后,加入Al(OH)3佐剂配制而成。在这三种疫苗的基础上又开发出了有I型和II型病毒按1:1配伍制备的双价疫苗。由于上述疫苗的生产使用原代细胞,尽管对于控制肾综合征出血热的流行起到了一定的作用,但是也存在以下问题: 1、使用原代细胞生产,需要大量的清洁级动物,在扩大生产规模时受到一定的限制。 2、在生产过程中难以避免实验动物中的外源因子进入制品中,直接影响疫苗质量。 3、抗原未经过浓缩、纯化,成品中的杂质多,在接种过程中容易产生严重的副反应,有效抗原含量低,易出现免疫失败。 为了解决原代细胞疫苗存在的问题,有必要开发接种效果好、副反应轻微的传代细胞纯化疫苗,为此,进行了双价肾综合征出血热纯化疫苗(Vero细胞)研制工作。本项研究主要完成了以下工作: 1、肾综合征出血热病毒SD9805株(I型汉坦病毒)和HB9908株(II型汉坦病毒),经鼠脑传代三代后,两个毒株的毒力均达到7.0 logTCID50/ml,使用高毒力的毒株继续在Vero细胞上进行适应,SD9805株在第六代,HB9908株在第五代,毒力达到并稳定在7.0 logTCID50/ml,分别传代到第十一代和第十代,病毒滴度达到最高(均为7.66 logTCID50/ml),通过与代表性病毒株交叉中和试验、不同的特异性单克隆抗体反应和鉴别试验,证明SD9805株为I WP=90 型汉坦病毒,HB9908株为II型汉坦病毒并可以作为疫苗生产用毒种。 2、研究了两种凝胶介质(Sepharose 4FF和Sephacryl 300HR)和两种离子交换介质(HiTrapTM-DEAE Fast Flow和HiTrapTM-SP Fast Flow)对疫苗的纯化效果,根据抗原量和SDS-PAGE分析结果确定了以Sepharose 4FF为纯化介质的纯化工艺。 3、本工艺生产的疫苗进行了异常毒性试验、抗原性试验、免疫原性试验和过敏原性试验,结果证明该疫苗无异常毒性,免疫原性好,抗体产生水平高,疫苗中不含过敏原。临床研究证明该疫苗接种后副反应轻微,抗体水平高。该项研究2003年11月通过了国家食品药品监督管理局的评审。


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