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抗DR4、DR5单克隆抗体诱导胶质瘤细胞株凋亡的研究

庄国洪  
【摘要】:TNF相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是Wiley新近发现的肿瘤坏死因子超家族成员。目前已确认了TRAIL的5种不同受体,其中死亡受体TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2(DR5)均含死亡结构域并能向细胞内传递死亡信号,当TRAIL与DR结合时可以诱导细胞死亡。其它3种受体(TRAIL-R3,TRAIL-R4 和OPG)作为“诱骗受体”可以逃避TRAIL诱导的凋亡作用。以死亡受体为靶点的肿瘤生物治疗是目前该领域的热点,人们已经构建了许多TRAIL重组体,有研究发现TRAIL体外应用时对正常人的肝细胞有严重毒性作用,因此寻找高效低毒的死亡受体激活剂成为研究目标。Ichikawa制备了DR5的特异单克隆抗体TRA-8,并发现TRA-8对正常肝细胞没有凋亡作用,而原发性及转移性肝细胞癌对TRA-8敏感。目前利用抗DR的特异单克隆抗体作用于神经胶质瘤细胞U343、U138、U373,诱导其凋亡的研究未见报道。为此,本文进一步研究抗DR的特异单克隆抗体对神经胶质瘤细胞的作用及其机制,为临床肿瘤的治疗提供理论依据。本研究主要分两部分进行 第一部分FMU1.4/FMU1.5诱导U343、U138、U373细胞株凋亡 1 DR4、DR5在细胞的表达 通过流式细胞仪、RT-PCR从蛋白质水平、mRNA水平分析DR4/DR5在胶质瘤细胞株的表达情况; 通过细胞组织化学方法分析DR5/DR4在细胞的分布情况。结果表明,DR4/DR5在三株细胞的表达情况不同,其中DR5在三株细胞表面均有表达, U343、U138、U373平均表达量分别为86.5%、22%、2.61%;DR4在U373的表达量甚微仅有0.11%,在U343、 WP=111 U138分别为5.53%、2.08%。DR5/DR4mRNA的表达也有差异,三株细胞均有DR5mRNA的表达,DR4在U373中未见表达。因此得到结论;DR4、DR5的蛋白质表达与mRNA的表达相符。通过细胞组织化学方法发现DR5在U343、U138、U373都有表达,DR5分布在细胞的胞质区,细胞核周围,这与文献报道相同。 2 FMU1.4/FMU1.5对三株细胞的杀伤 三株细胞U343、U138、U373经FMU1.4/FMU1.5作用4h,通过MTT法,FACS分析FMU1.4/FMU1.5对细胞的杀伤性,结果表明U343对FMU1.5敏感,并呈剂量依赖性;而其他两株细胞的敏感性不同:U138对其部分敏感,U373对FMU1.5耐受。U343对FMU1.4部分敏感,其他两株细胞对FMU1.4抵抗。总之,U343对FUM1.5敏感,FMU1.5对细胞的杀伤力强于FMU1.4。 3对凋亡的胶质瘤细胞形态学观察 FUM1.5 40ug/mL 作用后收集U343细胞,经光镜及电子显微镜观察发现:凋亡细胞形态改变不规则,细胞核浓缩边缘化或形成凋亡小体,线粒体基本保持完整。对照组没有上述改变。 4 DNA片段的定量及定性分析 FUM1.5/FUM1.4 40ug/mL 作用U343、U138、U373细胞4h后收集悬浮细胞,通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段。结果FUM1.5/Fum1.4处理后的U343可见明显DNA梯状带而其他组没有典型的梯状带。FACS分析DNA倍体发现不同抗体作用三株细胞所得到的结果不同。FUM1.5诱导的凋亡高于FUM1.4。 5 细胞色素C、FLIP的表达不同 为了确定细胞对FUM1.5/FUM1.4的敏感性与线粒体的关系,我们检 WP=112 测细胞质中的细胞色素C,发现细胞色素C在U343中高表达在U138、U373中表达低,而FLIP在U373中高表达在U138、U373中没有表达。 6 胞质中游离钙浓度的检测 静息细胞及FUM1.5/FUM1.4处理的细胞经钙荧光指示剂负载结果显示三株细胞内游离钙浓度不同,其中U343高于U138、U373,经FUM1.5/FUM1.4处理后三株细胞游离钙浓度增加,这表明当DR5与FUM1.5作用时钙依赖的核酸内切酶被激活。 这些结果表明,FUM1.5/FUM1.4通过凋亡机制杀伤胶质瘤细胞株,三株细胞对FUM1.5/FUM1.4敏感性与细胞的DR5/DR4的表达,胞内Ca2+浓度、细胞色素C、FLIP密切相关。 第二部分 改变细胞对FUM1.4/FUM1.5敏感性的策略 (一)dox 1 dox对DR4、DR5表达的影响 dox可以上调DR4/DR5在胶质瘤细胞的表达,dox作用后U343、U138 373中DR4/DR5的表达分别是15.2%,6.22%,2.82% 96.25,49.9%,9.34%。这表明DR5/DR4表达增加可以说是dox提高细胞对FUM1.4/FUM1.5敏感性的一种机制。 2 dox 对细胞色素C、FLIP的影响 为探讨抗体与dox的联合作用与线粒体的关系,在dox作用细胞24h后检测细胞色素C、FLIP的表达,Western-blot结果显示细胞色素C、在三株细胞的表达增加,在三株细胞检测不到FLIP的表达。 3 胞质中游离钙浓度的检测 细胞经dox作用24h后,检测钙浓度,三株细胞的浓度不同,U343高于U138、U373并且较未加dox时增高。提示dox作用后钙依赖的核 WP=113 酸内切酶被激活。 dox通过上调细胞DR4/DR5的表达,增强胞内Ca2+浓度、促进细胞色素c的释放、降低耐受株细胞FLIP的表达而改变细胞对FUM1.4/FUM1.5的敏感性。Dox与FUM1.4/FUM1.5具有协同作用。 (二) 5-Fu、Act-D 1 5-Fu、Act-D 对DR4DR5 表达影响 5-Fu、Act-D 作用U343、U373后细胞表面DR5的表达增加,分别是98.3%,86.4%,DR4没有改变。 2对细胞色素C、FLIP的影响 5-Fu、Act-D作用两株细胞后在两株细胞中检测不到细胞色素C、FLIP的表达。 5-Fu、Act-D与FUM1.5/FUM1.4联合应用可以提高FUM1.5/.FUM1.4对U343、U373细胞的杀伤,两株细胞对此种杀伤的反应不同。具体机制有待于进一步探讨。


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