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结缔组织生长因子在实验性肝纤维化中的表达及其抗体在抗肝纤维化作用中的实验研究

金珍婧  
【摘要】:肝纤维化、肝硬化是威胁人类健康的重大疾病,是各种慢性肝病共有的渐进性病理改变。其主要特征表现为以胶原为主要成分的细胞外基质(extra-cellularmatrix,ECM)各成分合成增多、降解相对不足而过量沉积。轻者称为纤维化,重者使肝小叶结构改建,假小叶及结节形成,称为肝硬化。活化的肝星形细胞(hepatic stellate cell, HSC或Ito细胞)、损伤的及再生的肝细胞、Kupffer细胞、窦内皮细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)等在炎症因素、毒素等刺激下产生的某些免疫介质或细胞因子,以自分泌或旁分泌方式作用于靶细胞受体发挥生物学效应,构成肝纤维化的主要细胞学基础。肝纤维化的形成过程不是静止的,而是不断变化的动态过程,近年的研究还表明,肝纤维化在一定情况下是可以逆转的,对逆转因素的研究将为进一步了解肝纤维化和肝硬化的发生机制提供重要线索。 肝纤维化的形成是一个多因素、多细胞参与的复杂过程,其中细胞因子网络始终是人们的研究热点,结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是一种新发现的细胞因子,被视为转化生长因子β1(TGF-β1)的下游反应元件, 在 TGF-(1的诱导下,CTGF可由成纤维细胞等间质细胞产生,反过来又介导TGF-(1对间质细胞的作用,具有促进成纤维细胞增殖以及参与细胞外基质(ECM)产生、积聚等功能,这在多种纤维化疾患的研究中已得到证实。在肝纤维化的体内和体外实验研究中,CTGF对肝星状细胞的分化增殖具有很强的调控作用,CTGF的异常高表达在肝纤维化的发生、发展过程中起着关键作用,已成为肝纤维化新的研究热点。 本实验在小鼠四氯化碳(CCl4)肝维化模型上, 采用RT-PCR和免 WP=96 疫组织化学方法检测了38只实验性肝纤维化小鼠肝脏中CTGF表达水平,并与I、III型胶原进行比较,观察CTGF-mRNA在实验性肝纤维化小鼠肝脏中的表达改变并探讨其意义。另一部分研究内容为制备模型开始及4周起分别应用CTGF抗体、天晴复欣预防和治疗肝纤维化,与正常对照组、染毒组及丹参组相比较,观察各组血清学指标、肝功能情况、氧化-抗氧化指标、肝组织羟脯氨酸含量、病理纤维化程度分级及CTGF、I、III型胶原水平变化,旨在为临床防治肝纤维化提供依据。 所得结果如下: ⑴ 肝纤维化小鼠肝组织中CTGF基因表达水平及蛋白质分子表达水平显著高于正常组小鼠(p0.01)。 ⑵ 所有实验组动物肝组织切片中I、III型胶原含量均显著高于正常对照组(P0.05 ~ P0.01)。 ⑶ CTGF表达量、I、III型胶原含量均与小鼠肝纤维化程度成正比,其r值分别为0.582、0.351、0.374,其中以CTGF的相关性最高(P0.01),其次为III、I型胶原(P0.05)。 ⑷ CTGF表达量与与COL-I和COL-Ⅲ的表达量成正比,其中CTGF与COL-Ⅲ,P0 05与COL-I,P0 01。 ⑸ 肝功能指标:各治疗组ALT、白蛋白和TBil与模型组比较均有显著改善 (P0.05 ~ P0.01)。其中天晴复欣预防组、CTGF抗体组较丹参组更为显著,天晴复欣预防组好于治疗组(P0 05)。 ⑹ 血清肝纤维化指标:各治疗组血清中HA、LN、PC-Ⅲ 、IV-CL水平与模型组比较均有显著降低 (P0.05 ~ P0.01)。 其中天晴复欣预防组、CTGF抗体组较丹参组更为显著,天晴复欣预防组好于治疗组(P0 05)。 ⑺ 氧化-抗氧化指标:各治疗组SOD、GST-PX显著高于模型组(P0.05 ~ P0.01),而MDA较模型组显著减低(P0.05 ~ P0.01)。其中天晴复欣预防组、CTGF抗体组较丹参组更为显著,天晴复欣预防组好于治疗组(P0 05)。 ⑻ 羟脯氨酸含量测定:各治疗组羟脯氨酸含量(μg/mg) 较模型组显著减低(P0.05 ~ P0.01)。其中天晴复欣预防组、CTGF抗体 WP=97 组较丹参组更为显著,天晴复欣预防组低于治疗组,但两者无统计学意义。 ⑼ 病理组织学观察: CTGF抗体和天晴复欣的预防组、治疗组肝纤维化程度明显轻于染毒对照组及丹参组(p0.01,p0.05),CTGF抗体组与天晴复欣组之间及预防和治疗组之间各项指标无显著差异。 ⑽ 丹参预防组、天晴复欣预防、天晴复欣治疗组及CTGF抗体组与CCl4模型组相比较,肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原及CTGF的含量有显著性降低(P 0.05~P0.01);天晴复欣预防组、天晴复欣治疗组、CTGF抗体组与丹参治疗组相比较,肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原及CTGF的含量有显著性降低(P 0.05);天晴复欣预防组与治疗组相比较,前者较后者Ⅰ、Ⅲ型胶原及CTGF的含量有显著性降低(P 0.05);天晴复欣预防组与CTGF抗体组相比各指标差异无显著性(P﹥0.05)。 上述结果提示: ⑴ CTGF在肝纤维化激活及调控中具有重要作用。 ⑵ 采用CTGF抗体封闭CTGF功能可能在肝纤维化防治中有重要作用。 ⑶ 进一步验证了天晴复欣抗肝纤维化的作用。 本研究的创新点及意义: ⑴ 首次应用RT-PCR及免疫组化方法检测了实验性肝纤维化小鼠肝脏中CTGF的表达。CTGF在肝纤维化组织中出现高表达,并与病理上肝纤维化程度相互平行,表现出与肝纤维化的发生发展极其密切的关系。但其确切的病理学机制目前尚不完全清楚,仍需进一步研究,而CTGF的受体和CTGF对细胞外基质合成影响的信号传递机制以及抗CTGF的治疗策略将成为未来重要的研究方向。


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