Ca～（2+）对周围神经损伤后运动神经元作用的实验研究

【摘要】：周围神经损伤后的功能恢复一直以来是创伤外科的重要研究内容之一。神经损伤后功能恢复与其相应的神经元细胞的功能状态直接相关。周围神经损伤是否引起相应神经元的凋亡，钙离子作为神经细胞内重要的第二信使，是否参与了细胞的凋亡，以及钙离子参与神经细胞凋亡的途径，已成为创伤外科医生的研究热点之一。目前在周围神经损伤与修复的研究领域，对神经元细胞的研究日益受到中外医学工作者的关注，但对Ca2+在周围神经损伤后对运动神经元的作用及其机制方面的研究，国内外相关报道较少。因此，本研究应用神经电生理的膜片钳技术、原位杂交、免疫组化等实验技术，研究周围神经损伤后相应的神经元细胞是否出现凋亡、细胞膜L型钙离子通道的变化情况、细胞内钙离子的变化以及神经元超微结构的变化，探讨周围神经损伤后神经元是否出现凋亡，钙离子对神经损伤后神经元细胞的作用以及神经元凋亡的信息传递通路，为提高周围神经损伤后的功能恢复提供相关的理论基础。 取成年Wister大鼠，随机分为假手术组（显露臂丛神经根，但不切断）、对照组（臂丛神经切断伤组）及实验组（臂丛神经切断伤+维拉帕米组）。在建立臂丛神经根性切断伤的动物模型基础上，应用钙离子阻滞剂，观察神经损伤后脊髓前角运动神经元的变化。 一、应用全细胞膜片钳技术检测钙离子通道 WP=97 在手术显微镜下将C5～T1脊髓节段连同硬脊膜一并取出，在无菌条件下，即刻在冰盒上仔细分离取出脊髓第Ⅹ板层的前角细胞，迅速置于培养液中，于培养24到48小时，取直径为50-70μΜ的细胞用于实验研究，应用全细胞膜片钳技术检测细胞膜上L型钙离子通道。 二、采用荧光分光光度计测定细胞内游离Ca2+浓度 将所取的脊髓前角组织研磨后制成细胞悬液，调细胞数为1×106，应用荧光分光光度计测定细胞内游离Ca2+浓度。 三、应用TUNEL法进行细胞凋亡的检测 四、透射电镜观察脊髓前角细胞的超微结构 五、应用原位杂交技术测定神经细胞内CaM 六、观察脊髓前角细胞内C-fos基因表达 七、神经元计数 研究结果显示： 一、神经损伤后，随时间的变化，神经元细胞膜钙离子通道电流发生变化。对照组神经元细胞膜钙离子通道在神经损伤后即开放，24小时后略有下降，此后维持在相对稳定的水平至神经损伤后1周，直至神经损伤后2周，才降至正常水平，实验组神经元细胞膜钙离子通道基本维持在正常水平。 二、对照组及实验组运动神经元细胞内钙离子浓度神经损伤后即开始升高，至神经损伤后48小时达高峰，此后逐渐下降，至神经损伤后1周，实验组已基本回至正常水平，对照组仍略高于假手术组，对照组与实验组及假手术组间仍有差异。 三、在神经损伤后的前48小时内，各组中均未见到凋亡的神经元细胞，从神经损伤后48小时开始，对照组与实验组中可见凋亡的神经元细胞，至神经损伤后1周细胞凋亡数达到高峰，此后，细胞凋亡数下降，至神经损伤后2周，对照组及实验组中仍偶见凋亡的神经元细 WP=98 胞。假手术组偶见凋亡的运动神经元。 四、从神经损伤后开始，神经元细胞体即开始发生一系列相应的变化，变化开始于神经损伤时，神经损伤后1周时，神经元细胞损伤最重，对照组神经元细胞核呈不规则形，胞质内可见粗面内质网、线粒体、核糖体和脂褐素，粗面内质网和核糖体数量减少，神经毡内大部分轴突轴质空化。神经胶质细胞对损伤的反应变化较神经元细胞体的变化更为明显，在神经损伤后，胶质细胞的内部结构发生很大的变化，染色质趋边、凝集，可见大量的溶酶体。实验组中神经元及神经胶质细胞的损伤程度均较对照组轻。 五、正常神经元细胞中有少量CaM表达，实验组与对照组神经损伤后CaM灰度值即开始下降，说明细胞内CaM含量增加，实验组神经损伤后48小时开始减少，对照组至神经损伤后72小时开始减少。但至神经损伤后2周时，实验组及对照组细胞中CaM含量仍较假手术组高。 六、假手术组整个实验过程中未见C-fos基因表达阳性细胞。实验组及对照组神经元细胞内C-fos基因表达的变化趋势表明，神经损伤后C-fos基因表达阳性细胞数即开始出现，两组均在神经损伤后48小时达高峰，此后逐渐下降，神经损伤后2周时，已基本看不到C-fos基因表达阳性的细胞。 七、神经损伤后48小时内未见神经元数量的减少，各组间神经元数量无显著差别，神经损伤后48～72小时实验组与对照组神经元细胞数减少比较明显，神经损伤后1周至2周间神经元数量减少速度相对减慢，各时间段间仍有差异。 通过本实验的研究结果，在实验性臂丛神经根性切断伤的动物模型中，神经损伤后，出现了细胞凋亡基因C-fos的表达，48小时达高峰，2周时，已基本恢复正常水平。神经损伤后出现脊髓前角运动细 WP=99 胞的凋亡，细胞凋亡于神经损伤后的48小时出现，至神经损伤后2周，仍可见凋亡的神经元细胞。应用钙离子阻滞剂后可减少C-fos基因表达，减少运动神经元的凋亡。C-fos基因表达的出现先于细胞凋亡，凋亡可能由C-fos基因引起。神经损伤后相应的神经元细胞膜上L型钙离子通道开放，钙离子内流进入细胞内，导致神经细胞内游离钙离子浓度的增加，L型钙离子通道可以被维拉帕米阻断，减少神经损伤后的钙离子内流，减