海洛因依赖对谷氨酰胺合成酶的影响及其相关机理的研究

【摘要】：躯体依赖性、精神依赖性及药物耐受性是阿片类药物3个最显著的药学特征，其机制一直是人们不断探索的课题。随着阿片受体，内源性阿片肽等的发现，有关阿片作用机理的研究进入了一个新阶段。从现在的研究情况来看，在阿片类依赖戒断时，涉及了神经系统、神经内分泌系统、细胞内信号转导调控系统、嘌呤核苷酸代谢系统等一系列复杂的微观调控系统的改变。 本课题研究的主要目的是探讨海洛因依赖与戒断对机体氨基酸代谢的影响，寻找与海洛因依赖及戒断作用相关的标靶基因：调控基因和效应基因。谷氨酰胺合成酶（GS）作为外周肝脏调控氨基酸代谢的关键酶以及中枢神经系统（CNS）中兴奋性神经递质谷氨酸——谷氨酰胺循环回路中的关键酶，其在阿片类药物成瘾与戒断中的作用国内外尚未有相关报道。通过国内外大量最新文献分析，我们以谷氨酰胺合成酶为锲入点从氨基酸代谢的角度为深入研究海洛因依赖与戒断机理提供一个新的方向。 以实验动物中枢神经系统，肝脏，肌肉等不同系统组织在酶学水平及基因转录水平，通过对GS的基因表达与调控及其相应的生化代谢变化等机制的研究，来阐明海洛因是否影响了氨基酸代谢变化以及其变化是否参与了海洛因依赖与戒断现象的形成，并为阿片类依赖患者的治疗及治疗药物的可能作用靶点提供理论依据。 一．许多实验表明，星形胶质细胞的谷氨酸转运体对于突触内谷氨酸递质的清除，保持胞外谷氨酸浓度稳定方面起重要作用，已有相关研究报道， WP=64 胞内谷氨酸至谷氨酰胺的代谢途径起关键作用的谷氨酰胺合成酶同样具有增强胞外清除的作用。1、本实验3天及9天海洛因给药组大鼠大脑顶叶组织谷氨酰胺合成酶活性水平明显低于对照组，GS活性降低表明：星形胶质细胞及神经元之间代谢偶联途径（谷氨酸—谷氨酰胺循环）中，谷氨酸转变流量发生改变。并影响星形胶质细胞对胞外谷氨酸神经递质的摄取导致细胞外组织液及谷氨酸能系统神经突触内谷氨酸浓度增加。 从实验我们发现海洛因自然戒断3天组及自然戒断8天组GS活性与自然戒断开始组即海洛因给药9天组相比仍继续下降，与对照组相比下降更为显著。GS活性海洛因戒断期间的进一步下降，我们对此结果进行分析认为可能是神经组织中组织液及谷氨酸能神经系统突触内谷氨酸浓度增高加剧的主要原因之一。吗啡戒断综合征是吗啡躯体依赖性的主要表现，近来的研究资料表明，谷氨酸能系统参与了吗啡躯体依赖性的表达。有关实验显示（Iftach shaked,2002）GS活性可以显著影响谷氨酸的摄取并推断在神经正常生理功能维护机制方面是一重要的作用标靶。据此我们认为，在海洛因依赖形成及戒断期间，胶质细胞内GS活性的显著下降，导致胞外组织液及突触间隙内兴奋性氨基酸递质谷氨酸浓度的增高，从而打破了神经生理功能正常调控机制的平衡。考虑到谷氨酸能系统在神经可塑性及学习记忆中的作用，并且研究发现，阿片类药物依赖大鼠大脑组织多个部位中均出现谷氨酸浓度增加。作为谷氨酸代谢途径中起关键作用且广泛分布的神经胶质细胞中的GS可能是阿片类药物躯体依赖性及精神依赖性形成的重要作用标靶之一。自然戒断9天组与自然戒断3天组比较GS活性水平并没有恢复正常趋势，一直维持在较低水平。从此结果推测，海洛因对脑组织中胶质细胞内谷氨酸代谢的影响并不随给药的停止而立即消失，而是可以保持较长的时间，从而有利于谷氨酸能系统在神经可塑性方面的影响。大脑顶叶组织GS RT-PCR结果分析表明：海洛因依赖戒断期间大脑顶叶组织 WP=65 GSmRNA转录水平趋势与蛋白质表达水平并不完全成正相关，由此可见，海洛因对GS活性的影响有不仅发生在基因转录水平，也可能发生在翻译与蛋白质调控水平。 从海洛因脑干组织GS活性的变化我们看到，海洛因给药3天组及海洛因给药9天组，脑干组织中GS活性与对照组相比无明显差异。自然戒断3天组GS活性显著下降。除脑神经核以外，脑干灰质中还有许多功能各异的重要核团。如下橄榄核、红核、黑质等。以及脑干网状结构，其在调节肌张力，内脏活动及影响大脑皮质活动维持觉醒状态起重要作用。延髓网状结构中有些核团，与呼吸和心血管等维持生命的运动有关。本实验结果显示，自然戒断期间GS活性下降，我们推测星形胶质细胞内GS有可能是海洛因依赖戒断初期生物个体呼吸，循环，消化等多系统产生变化的原因之一。 在肝脏组织中，3天及9天海洛因给药组，GS活性较对照组增加。许多实验研究发现，阿片类药物依赖与戒断状态下，生物体体重下降，推测可能伴有物质分解代谢的加强。肝脏作为动物个体，物质能量代谢中枢，并已证实肝脏内μ受体的表达，所以本实验选定肝脏作为研究对象之一，通过海洛因对肝脏组织中GS活性的影响来初步探讨海洛因对于蛋白质代谢的影响。当机体处于分解代谢时，肝脏L- 谷氨酰胺数量和流向发生改变，尿素合成受抑制。L-谷氨酰胺合成酶活性增强，肝脏利用胺合成L-谷氨酰胺，最终有利于缓解骨胳肌蛋白质的降解程度。自然戒断3天组及8天组，肝脏GS活性水平下调，并恢复到对照组水平，说明海洛因依赖大鼠自然戒断3天后，其肝脏GS活性水平既可恢复至正常水平。海洛因依赖肝脏组织GSmRNA转录水平趋势与蛋