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RNA干涉用于Survivin性质的研究

王瑞瑛  
【摘要】:Survivin 是1997 年Ambrosini 等应用EPR-1 基因cDNA 作为探针去筛选人基因组文库而得到的,是IAP 家族的一个成员,以其独特的分子结构以及表达特点,在其被发现后的几年中得到广泛的研究与关注。 本论文中,我们用蛋白合成抑制剂放线菌酮CHX处理宫颈癌细胞HeLaS3,并用Western-blot 检测,发现60min 后Survivin 蛋白的表达量明显降低。而用PKA 的抑制剂H89 预先处理细胞两个小时后,再用CHX 处理细胞,则Survivin蛋白量变化不明显。我们推断,Survivin 的稳定性可能与其潜在的PKA 磷酸化位点的磷酸化状态有关。 进而通过序列比对,我们选择出三条针对Survivin 基因的siRNA 片段,并构建了相应的RNAi 载体,转染入HeLaS3 细胞后,瞬时转染的结果表明,Survivin 表达量在RNA 和蛋白水平上都得以下调,尤以S3 片段效果最为明显,并且用流式细胞术检测干涉载体转染对细胞产生的生物学效应,发现转染干涉载体pTet-U6-S3 后,细胞凋亡率得到很大的提高。 另外,我们构建了Survivin 上潜在的pKA 磷酸化位点Ser81 的突变体S81D、S81A,用来检测该位点磷酸化不同状态对Survivin 稳定性的影响。 但是把干涉载体转染至细胞,并把其培养成稳定株后,HeLaS3 细胞内源Survivin 量并没有被有效地抑制,这是很出乎预料的。


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