鸡IL-2基因的克隆、原核表达及对DNA疫苗免疫增强作用的实验性研究

【摘要】：根据Sundick 等发表的鸡IL-2 基因(chIL2)序列设计并合成了特异性引物,以经ConA 诱导的鸡脾淋巴细胞提取的总RNA 为模板,用RT-PCR 方法扩增出450bp 的目的片段,并将其克隆到pBluescriptⅡKS(+)载体上,酶切鉴定及序列测定结果表明该基因为鸡IL-2 基因。它包括鸡IL-2 基因的全部开放阅读框,编码由142 个氨基酸组成的蛋白质。与GeneBank 上已知的鸡IL-2 基因相比,除在编码氨基酸的第49 位缺失一个氨基酸外,其他与Broiler、SC、Chenren 和Xiaoshan鸡完全一致,具有较近的亲缘关系;与Kestrel 来航鸡、来航SPF 鸡、Obese、Silky和Xianju 鸡等相比有1~4 个氨基酸的差异。经序列分析表明,该基因是目前发现的唯一有氨基酸缺失的鸡IL-2 基因。 将克隆的鸡IL-2 基因亚克隆到GST 融合基因表达载体pGEX-6P-1 的相应位点,构建重组表达载体pGEX-cIL2。将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,用0.1mM 的IPTG 进行诱导,SDS-PAGE 分析表明,在相对分子质量约为40kD (融合蛋白)处有明显的蛋白质表达条带,而未经诱导的pGEX-cIL2 在40 kD 处无条带产生,表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的50%左右。结果表明pGEX-cIL2 能够表达GST-chIL2 融合蛋白,其中鸡IL-2 分子量为14kD,与预期的鸡IL-2 成熟蛋白大小一致。 以含鸡IL-2 基因的质粒载体为模板,设计一对用于真核表达的引物,扩增出鸡IL-2 基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3 的相应位点,构建了鸡IL-2 基因的真核重组表达质粒pcDNA-cIL2。经酶切、PCR 鉴定及序列测定分析,结果表明所构建的重组质粒为鸡IL-2 基因特异性真核表达质粒。 构建的真核表达质粒经纯化后,与表达鹅副粘病毒HN 蛋白的DNA 疫苗共同免疫14 日龄SPF 鸡,14d 后加强免疫,二免后14d 用致死剂量的鹅副粘病毒强毒攻击。结果表明表达质粒pcDNA-cIL2 能够增强鹅副粘病毒HN DNA 疫苗对强毒的攻击,保护率达65%;血凝抑制试验也证实,共注射pcDNA-cIL2 组诱导的HI 抗体较单纯免疫HN DNA 疫苗组高2~3 个滴度。