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白喉毒素-α促黑素重组毒素的制备及其特异性毒性研究

李泽鸿  
【摘要】:本文构建了DAB_(389)(Gly_4Ser)_2-αMSH重组毒素,并对它的分子生物学特征、培养条件、发酵条件、纯化条件及特异性毒性进行了探索和实验。 以pET28a/DAB_(389)(Gly_4Ser)_2EGF为模板,扩增出DAB_(389)-(Gly_4Ser)_2-αMSH片段,将片段插入到原核表达载体pET28a(+),构建了重组表达质粒pET28afDAB_(389)(Gly_4Ser)_2-αMSH;并在大肠杆菌中进行了高效表达。免疫印迹分析显示可与马抗白喉抗体发生特异性免疫反应。 探索了目的蛋白的优化表达条件,蛋白表达量为28.64%:发酵培养湿菌产量达到16.5g/L;目的蛋白经亲和层析柱一次纯化,纯度达到90.53%;利用Xa因子切割蛋白,制备电泳分离后,目的蛋白的纯度达到93.26%;检测了目的蛋白对SP2/0、HeLa、A549、A375细胞的IC_(50):BALB/c鼠荷瘤实验表明抑瘤率达到64%。 本实验的创新:首次构建了DAB_(389)(Gly_4Ser)_2-αMSH重组毒素,并插入了His·Tag和Xa因子的切割序列,增强了目的蛋白的活性,减少了生产成本和纯化程序。


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