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人HSP70在毕赤酵母中的表达鉴定及大规模发酵和纯化工艺研究

马杰  
【摘要】:本研究利用基因重组技术构建了人HSP70 真核表达载体pPICZα/hhsp70,电转化毕赤酵母X-33 后,筛选出稳定高效的分泌表达rhHSP70 的工程菌株。经SDS-PAGE,Western blot,亲和层析和离子交换层析纯化及N-端氨基酸测序分析证明rhHSP70 与天然hHSP70 具有相同的序列和理化性质。同时利用固相多肽合成法合成了人HER2/neu蛋白的CTL表位P106-114和P369-377,并在体外与rhHSP70形成复合物,用rhHSP70-多肽复合物和GM-CSF+多肽分别免疫小鼠,进行诱导HER2/neu蛋白特异性CTL的实验研究。结果表明:rhHSP70-多肽复合物比GM-CSF+多肽更有效地促进T淋巴细胞分泌IFN-γ,诱导特异性CTL杀伤表达人HER2/neu蛋白的小鼠乳腺癌细胞,并使肿瘤组织出现大范围的坏死和凋亡,对乳腺癌模型小鼠的治疗作用也明显优于GM-CSF+多肽。说明rhHSP70 具有与天然hHSP70 相同的免疫活性。进而在80L发酵条件下,进行了rhHSP70 表达条件的优化,并建立一种适合于大规模纯化rhHSP70 的新方法。 本实验的创新之处在于:1)首次在毕赤酵母中高效表达了rhHSP70 ;2)首次证实将HER2/neu蛋白的CTL表位P106-114和P369-377与hHSP70 结合形成复合物,可诱发机体强大的特异性免疫反应,用于乳腺癌的免疫治疗;3)建立了大规模发酵和纯化rhHSP的新方法。


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