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双色荧光RNAi技术平台的建立和抗SARS-CoV RNAi的研究

魏映辉  
【摘要】:RNA干涉(RNAi)是由双链RNA引起的同源RNA降解的现象,和病毒基因同源的小双链RNA可能成为新型的抗病毒药物。 为了研制抗SARS-CoV的RNAi,建立了由两种质粒pcDNA3.0/GFP-X及pcDNA3.0/DsRed-U6-Y组成的反式双色荧光RNAi技术平台。pcDNA3.0/GFP-X载有与绿色荧光蛋白(GFP)基因位于同一读框的靶基因(X);在pcDNA3.0/DsRed-U6-Y的CMV启动子下游构建有红色荧光蛋白(DsRed)基因,在人U6启动子的下游可组装任一有干涉作用的小发夹RNA(shRNA)编码基因(Y)。用这两种重组质粒共转染细胞后,通过荧光显微镜或流式细胞仪选择性地分析显示红色荧光的细胞群中绿色荧光减弱的程度,以此来对任一靶基因进行定性及定量的RNAi研究。 采用此技术平台,我们对根据SARS-CoV的核衣壳蛋白(NP)第953~971bp自行设计的小发夹RNA(shNP953)进行了RNAi研究,结果发现,这一新型小发夹RNA(shNP953)可以有效干涉SARS-CoV NP的表达。该结果为研制新型抗SARS病毒的药物提供了实验依据。 此外,我们采用U6启动子-shRNA基因的PCR产物对多种自行设计的SARS-CoV同源shRNA的RNAi效应及其非特异性作用进行了初步的探讨。


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