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鲤鱼(Cyprinus carpio L.)外周血白细胞cDNA文库的构建和差异表达基因的筛选

李莲瑞  
【摘要】:为了研究鲤鱼外周血白细胞差异表达基因的结构、表达和功能,本研究利用HybriZAP-2.1 cDNA文库构建试剂盒构建了鲤鱼正常和有丝分裂原刺激的外周血白细胞cDNA文库。有丝分裂原刺激的外周血白细胞cDNA文库的原始库容量为1.67×10~6pfu/ml,插入片段长度在0.4×103~3.0×10~3bp,重组率为98.9%,扩增文库的滴度为6.16×10~9pfu/ml。正常外周血白细胞cDNA文库的原始库容量为5.79×10~6 pfu/ml,cDNA插入片段大小介于0.4×103~3.0×10~3bp,重组率为99.4%,扩增文库的滴度为4.22×10~9pfu/ml。以体外正常培养和有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞为实验材料,用荧光mRNA差异显示技术,共获得92个差异片段,其中87个片段有再扩增产物,经纯化后,与pMD-18T载体连接、转化DH5α,获得60个阳性克隆,序列分析显示24个cDNA序列与基因数据库的已知基因没有同源性,36个基因序列与已知基因序列有一定的同源性,其中有5个与免疫应答有关,它们是C15(C30)、A26、C34、A35、B15克隆,分别编码蛋白酶体激活剂PA28-β亚基、CXC趋化因子、胸腺素、B细胞增强因子、基质金属蛋白酶。用地高辛标记的C15和A26为探针,对有丝裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,获得了鲤鱼PA28和IL-8的全长cDNA。实验初步研究了有丝分裂原LPS、PHA和ConA刺激鲤鱼外周血白细胞前后和嗜水气单胞菌刺激前后鳃、肾、脾、肌肉、心、脑、肝组织的PA28亚单位mRNA的表达量变化,旨在研究鲤PA28体内表达的调控机理,分析PA28在鲤鱼MHCⅠ类抗原应答和呈递中的作用机制。对IL-8有丝分裂原LPS、PHA和ConA刺激鲤鱼外周血白细胞前后的mRNA的表达量变化做了分析,旨在阐明鲤鱼IL-8在免疫和炎症过程中的调节机制。Northern杂交显示, IL-8基因经有丝分裂原LPS和PHA刺激后,能在鲤外周血白细胞中表达。Southern杂交结果可以初步断定该基因在鲤鱼基因组内不是单拷贝基因。


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