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质粒D-GPEi纯化工艺及质量检测研究

孙博  
【摘要】:质粒DNA应用于核酸疫苗和基因治疗的需求快速增长,需要建立一套大规模生产质粒DNA工艺及与其相应的检测方法。本论文系统地研究含有重组质粒D-GPEi工程菌破碎条件、重组质粒D-GPEi分离纯化及质量检测方法。 首先对碱裂解法提取质粒DNA和煮沸裂解法提取质粒DNA方法进行比较,观察碱裂解过程中悬浮体积比例、碱裂解时间、3种碱裂解反应液比例、盐离子浓度对碱裂解过程中质粒DNA的影响;再应用离子交换层析、分子筛层析、疏水层析、亲和层析等不同原理色谱柱对质粒DNA进行纯化,摸索各种原理色谱柱最佳洗脱条件。依据每种方法去除污染物能力、质粒DNA回收率大小、质粒DNA构象的影响,得到了优化的质粒DNA生产工艺。 依照《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》,对质粒DNA最终产品进行质粒DNA浓度测定、质粒DNA限制性内切酶鉴定试验、杂蛋白残留含量测定、细菌内毒素含量测定、大肠杆菌基因组DNA测定、无菌实验。检测结果符合药用标准。


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