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定点突变人源化含硒单链抗体酶

王琳琳  
【摘要】:谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是生物体内抗氧化酶系的重要成员之一,它利用硒代半胱氨酸(Sec)作为催化官能团,通过谷胱甘肽(GSH)催化还原氢过氧化物,从而保护细胞免遭氧化损伤,因此,它作为抗氧化剂具有广泛的药用价值。但由于天然GPX来源有限、纯化困难和难于用DNA重组技术生产等不利因素,制备具有高GPX活力的人工模拟酶具有很高的实用价值。 我们实验室将利用蛋白质工程法制备的鼠源单链抗体进行改型,构建了人—鼠嵌合的人源化单链抗体库,通过噬菌体抗体库的筛选获得了ELISA信号较高的噬菌体阳性克隆B14,通过PCR方法扩增目的基因并将其克隆至表达载体pPelB中,在E.coli.Rosetta中进行蛋白的表达,对表达蛋白进行纯化及鉴定,然后用化学突变法引入催化基团硒代半胱氨酸(Sec),结果表明其GPX活力为880 U/μmol,较鼠源单链抗体的GPX酶活力低很多。提取质粒经DNA测序结果表明,有3个核苷酸与设计的位点不同,分别改变了位于VL区Gln27、Val90和VH区Lys13,分析其较低的GPX活力应该是由于DNA序列发生了改变,使scfv的空间构象发生了改变,才导致GPX酶活力不高。 本文通过重叠PCR法进行定点突变修正错配碱基,序列测定表明获得了DNA顺序正确的人源化单链抗体,用PCR法扩增出目的基因,然后首先将其亚克隆至pGEM-TEasy载体中,蓝白斑筛选获得阳性克隆后用酶切法和序列测定验证阳性,再用PCR法扩增出目的基因,克隆至表达载体pPelB中,经双酶切和序列测定鉴定阳性克隆后,将其转化入E.coli Rosetta、C43、JM 109和BL21(DE3)中确定最佳表达菌株为E.coli Rosetta,然后通过对菌体浓度、诱导物IPTG浓度、诱导温度和诱导时间4因素2水平的正交实验确定目的蛋白表达的最佳条件,对表达的蛋白用CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换树脂和Ni2+金属离子层析树脂进行纯化后,用Western-blot验证纯化蛋白,经化学突变引入催化基团—Sec,获得的硒化单链抗体的GPX活力是1680 U/μmol,是突变前硒化单链抗体的GPX活力的2倍。


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