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枯草杆菌脂肪酶的定向进化

嵇冶  
【摘要】:本文从原始的枯草杆菌质粒pBD64出发,通过设计两段DNA片段,引入了多个酶切位点和一个强启动子序列,构建了一个枯草杆菌脂肪酶高表达质粒pBSR2;该质粒载体与一段成熟的脂肪酶基因相连接,在枯草杆菌宿主中实现了高效表达。通过对枯草杆菌脂肪酶BSL的表达、分离和纯化,进一步研究了这种酶的分子量、酶活力、最适反应温度、最适反应pH、反应动力学等基本酶学性质。 通过采用易错PCR和DNA改组策略,对枯草杆菌脂肪酶进行了酶活力定向进化研究。经过两轮的易错PCR和一轮的DNA改组,获得了一株酶活力提高4.5倍的突变体。对突变菌株进行表达纯化后,对其酶学性质也进行了与野生型的对比研究。经基因测序和蛋白分析,进一步解释了对突变体酶活力和稳定性提高的可能机制。


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