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人肌红蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

车媛媛  
【摘要】: 目的:构建肌红蛋白的原核表达载体pQE-H-Mb。利用大肠杆菌M15[pREP4]表达重组蛋白,并通过镍凝胶亲和层析纯化表达的目的蛋白。为进一步开发应用奠定基础。 方法:根据已报道的肌红蛋白(Mb)基因序列,采用RT-PCR的方法获得肌红蛋白基因。将所得的PCR产物插入原核表达载体pQE30中,得到重组质粒(pQE-H-Mb)并转化大肠杆菌(E.col)M15[pREP4],通过IPTG诱导表达出带有六个组氨酸的融合蛋白。经镍凝胶亲和层析纯化。 结果:序列分析表明:Mb基因成熟肽编码区含有465bp,编码153个氨基酸;与GenBank(NM203378)中已报道的肌红蛋白核苷酸序列有98.5%的同源性。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白的量显著,分子质量约为16.7KD并与商品化的Mb单抗呈特异性反应。经Ni2+-NTA agarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。 结论:在大肠杆菌中获得了人肌红蛋白的高效表达,为研究其生物学功能和制备单克隆抗体奠定了基础。


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