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抗奶牛孕酮单克隆抗体的制备及酶联免疫检测方法的建立

冯晓琼  
【摘要】: 奶牛、黄牛发情周期中由卵巢的黄体产生孕酮,分泌入血液、乳汁、唾液、尿液中,浓度在发情期最低,到发情中期因黄体成熟而达最高水平。 本研究以甾体激素孕酮为研究对象,采用琥珀酸酐法活化11ɑ-羟孕酮,碳二亚胺法使其与载体蛋白发生偶联。经两次试验,成功地实现了孕酮此种小分子物质与大分子载体蛋白的偶联,完成了完全抗原(包括免疫抗原和检测抗原)的制备,并进行了免疫学方面的鉴定。按不同的免疫程序,将试验小鼠分组,用免疫抗原免疫小鼠,经效价测定后选择效价较高的一组融合用。 运用经典的PEG融合法,经两次融合,共得到3株单抗,分别是1F6、2A11、2G6。其中1F6为IgG型,其余为IgM型。腹水经ELISA法测定效价达到1︰1×106;1︰1×105;1︰8×104。三株单抗的相对亲和力为:1F62G62A11,分别识别两个以上的抗原位点。 针对单抗特异性强,亲和力高的特点,经酶标记的抗原、未经标记的抗原与单抗发生竞争性酶联免疫反应,用单抗检测抗原,并优化各项检测条件,绘制标准曲线,曲线的工作浓度范围为:0.5~100ng/ml。初步建立了孕酮含量的ELISA检测方法。


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