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动物性食品中主要致病菌复合前增菌技术及基因芯片检测方法的建立与应用

王金玲  
【摘要】: 食品安全是事关人民健康和构建和谐社会的重大战略问题,综合国际和国内食品安全问题的现状,动物性食品安全事件频发,其中动物性食品中的致病菌是食品安全问题的首要原因。面对日益严重的动物性食品安全问题,大力研究和发展新型、快速、灵敏、集成、高通量的检测技术,已成为一个重要方向。 本研究在基因芯片技术平台上,搭建动物性食品中主要致病菌高通量、快速、并行性的检测体系。研究一种能够提高该体系准确性和检测灵敏度的多种致病菌复合前增菌技术。对引发动物性食品安全的沙门菌、EHEC O157:H7、金黄色葡萄球菌、志贺菌、小肠结肠炎耶尔森菌、产单核细胞李氏杆菌、空肠弯曲菌的二十二种增菌培养基,筛选出NB和BPW。制备污染量为1~10cfu/ml的实验样品,比较七种致病菌单独、复合、检测样品在NB和BPW中的增菌效果,选择平板鉴定实验和PCR扩增实验结果表明NB较BPW更适宜七种致病菌的复合生长繁殖,细菌增殖量为10~3~10~9cfu/ml。 为了提高基因芯片杂交特异性和灵敏度,通过在16SrRNA、23SrRNA基因的保守区设计三对通用引物,建立了七种致病菌多重PCR扩增方法。研究设计了14×4的芯片点阵点样图。筛选七条特异性探针,制备寡核苷酸阵列芯片。应用荧光标记物Cy3或cy5标记扩增产物,进行基因芯片杂交实验。采用信噪比方法分析该基因芯片达到阳性的杂交信号,即阳性信号高于背景平均值10倍以上,阳性点与质控点的平均值比值要在0.4以上。BLAST结果显示本实验所设计的七种致病菌的探针具有种属特异性。七种致病菌基因芯片杂交检测灵敏度最低为670cfu/ml。稳定性、重复性、干扰性等实验结果表明,该芯片的稳定性和重复性均很好。基因芯片方法同传统的国标方法、PCR方法、快速仪器设备鉴定方法相比较,结果证明唯有基因芯片方法能够解决多种致病菌的一次性检测、且快速、准确、灵敏度高、特异性强。 通过实验优化的条件研发了动物性食品中主要致病菌基因芯片检测试剂盒,通过基因芯片方法对辽宁地区近400批次的进出口动物性食品中致病菌的检验,检出鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、EHEC O157:H7等34批,通过国标方法验证了该34批阳性样品的基因芯片检测方法的准确性。


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