狂犬病病毒的RNA干扰研究

【摘要】： RNA干扰(RNAi)是广泛存在于生物体内的小双链RNA诱导的mRNA水平的基因表达沉默现象,RNAi对基因表达的调控、病毒感染的防护、基因转座的控制等都具有重要的意义。随着RNAi机制及其应用研究的不断深入,许多学者以人工诱导RNAi的方式进行了病毒复制的干扰研究,并取得了良好的进展,也为狂犬病的暴露后治疗研究开辟了新的探索领域。本研究针对狂犬病病毒的体内外复制进行了RNA干扰的成功探索,为siRNA应用于狂犬病病毒的基因功能研究以及狂犬病的暴露后乃至发病后治疗积累了必要的实验数据。 基于质粒pSilencer2.1-U6 Hygro(Ambion),构建了以小鼠U6启动子为调控元件的siRNA表达载体共31个;上述载体转染BHK-21细胞,在潮霉素压力下,筛选获得siRNA稳定表达细胞株22株,其中BHK-N19(98.9%)和BHK-G69(94.6%)对狂犬病病毒复制的抑制率超过90%,RNAi效应与细胞培养时间无明显相关;针对靶序列N19、G69合成的21nt的双链siRNA分子,瞬时转染BHK-21单层细胞后,对狂犬病病毒的复制抑制率分别为86.7%和78.9%,但随转染时间延长,RNA干扰效率降低;质粒p2.1-G69及合成分子siRNA-G69对小鼠感染模型体内狂犬病病毒的复制具有明确的干扰效应,肌注后可使小鼠模型发病率显著降低,发病时间显著延长;但以p2.1-G69进行小鼠狂犬病感染模型的前驱期治疗,无明显疗效。