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荧光染料CFDA-SE标记在检测淋巴细胞增殖及细胞介导的细胞毒活性中的应用研究

段秀梅  
【摘要】: 羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)是一种膜通透性的荧光素染料, CFDA-SE标记细胞后转变成CFSE形式,随细胞分裂被平均分配到两个子代细胞中,其荧光强度是亲代细胞的一半。这样,在一个增殖的细胞群中,各连续几代细胞的荧光强度以2倍递减为特征,利用流式细胞术在FL1检测通道进行分析。 本实验以CFDA-SE作为细胞标记物,结合流式细胞术分析小鼠淋巴结、胸腺、脾淋巴细胞,在不同多克隆刺激剂作用下的增殖分裂;分析PHA刺激的人PBMC、诱导的CIK细胞的增殖情况,从而对CFDA-SE检测淋巴细胞增殖的意义进行评价。结果证明:用流式细胞术通过分析CFSE荧光强度可以在单细胞水平上判断细胞的分裂次数,比较外周淋巴细胞、胸腺细胞、CIK细胞以及T、B细胞在不同刺激剂作用下的分裂增殖程度,并结合荧光标记特异抗体可以进一步分析淋巴细胞亚群的增殖。 以不同浓度的CFDA-SE标记不同肿瘤细胞系,研究荧光强度变化的时间动力学;研究CFDA-SE对细胞的毒性;选择CFSE标记细胞的最佳浓度、最佳标记时间。通过实验证明CFDA-SE标记细胞4h后荧光强度趋于稳定;CFDA-SE标记细胞能力强,不同细胞CFDA-SE最佳标记浓度不同。CFDA-SE无毒性,不影响细胞活性。CFDA-SE标记细胞8分钟即可。这为其更好的应用于检测细胞毒实验提供依据。 本实验用CFDA-SE标记靶细胞,以区分效应细胞,再用DNA染料碘化丙啶PI标记膜受损的靶细胞,用流式细胞术计数CFSE/PI双阳性细胞,在单细胞水平上精确量化靶细胞死亡的百分率,从而判定人PBMC、CIK细胞、小鼠脾细胞三种效应细胞的细胞毒活性;检测CIK细胞杀伤不同肿瘤细胞及凋亡途径;并与51Cr释放法进行比较,证实本方法适用于低效靶比和共孵育时间较短的细胞毒检测,其敏感性高于51Cr释放法。结合荧光标记特异抗体还可以多参数定性分析靶细胞。优化了实验参数,用少量的效应细胞,可以提供连续可比较的结果。


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