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牛乳铁蛋白ELISA检测试剂盒的研制

冯挺财  
【摘要】: 乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是牛乳中正常存在的一种糖蛋白,当奶牛患乳腺炎时,其在牛乳中含量与炎症发生的程度呈正相关,且不同的病源感染时,其含量变化也不相同,因此可以通过检测牛乳中LF含量的变化来作为判定奶牛乳腺炎感染情况的一个参考指标。 本实验首先利用杂交瘤技术获得三株抗牛乳铁蛋白杂交瘤细胞株(2E5、2D3、3B8)进而制备了三株细胞株的腹水,并采用辛酸-硫酸铵法和HiTrap Protein G HP亲和层析柱进行纯化,对三株单抗的效价、亚类、相对亲和力、交叉反应性、抗原结合位点进行了分析鉴定并采用简易过碘酸钠法用辣根过氧化物酶(HRP)标记2E5。结果表明单抗及HRP-2E5均符合诊断试剂要求。建立及优化了检测LF含量的直接竞争酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、间接竞争ELISA(ci-ELISA)及双抗夹心ELISA三种检测方法。 利用37℃加速破坏性试验筛选出了能使包被抗原后的酶标板、标准抗原,2E5及酶标抗体在4℃保存一年以上的保护稳定剂。通过以上三种ELISA检测法的比较最后采用间接竞争ELISA法及试剂保护稳定剂组装乳铁蛋白定量检测试剂盒,并对试剂盒的各项技术参数进行测试,表明该试剂盒与牛乳中其他四种正常存在的蛋白酪蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和血清白蛋白的交叉反应率均小于0.1%;检测灵敏度为105.6ng/mL;批内及批间变异系数分别为4.35%、4.78%;在稀释液中人工加入标准品牛乳铁蛋白样品,回收率为91.56%~109.20%;37℃加速破坏性实验表明试剂盒在4℃至少能保存一年,检测时间约为3.5h。


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