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抗PEA单抗和单链抗体制备及在绿脓感染中的应用

万忠海  
【摘要】: 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginodsa PA)是导致外科手术或烧伤细菌感染死亡的最主要的病原细菌之一。绿脓杆菌外毒素A(PEA)是该菌的主要致病因子之一。PEA分为三个(I~III)功能区,I区与易感细胞识别有关;II区与PEA的“跨膜移位”有关;III区具有细胞毒性作用。PEA的毒性是其I区与细胞表面受体结合后,由受体介导的一系列反应引发的。所以抑制I区与受体的结合就可以阻断毒素的全部毒性作用。 为获得绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白,本研究将PEA受体结合区亚单位基因克隆到表达载体pET28(c)中,构建了原核表达质粒pET-28(c)+B10,表达了重组的绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白,进行了免疫学实验。进而利用该蛋白免疫Balb/c小鼠制备了抗PEA单克隆抗体,抗PEA(3C6)单克隆抗体经过正辛酸和硫酸铵纯化后,对严重绿脓杆菌感染小鼠进行了疗效实验,效果明显。 在此基础上,采用RT-PCR重叠延伸剪接法方法构建了单链抗体基因,并将基因克隆入pET28a中,筛选得到重组表达质粒pET28a-(PEA-1)ScFv。通过表达、变性、复性、纯化之后,进行了PEA的细胞毒性抑制实验。单链抗体在高浓度下能够起到一定的抑制作用。 本研究旨在寻求治疗烧伤后绿脓杆菌感染的新方法新途径。


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