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犬瘟热免疫层析试纸及荧光定量PCR诊断方法的建立与评价

苏建青  
【摘要】: 犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种危害严重的传染病。虽然犬瘟热疫苗已经被广泛使用很多年了,但是犬瘟热目前仍是危害犬类、毛皮经济动物、野生动物和部分海洋哺乳动物的重要疾病。由于犬瘟热临床症状的多样性,并且常伴随并发或继发感染,导致犬瘟热的临床确诊很困难。因此,建立一种快速、准确、特异和灵敏的诊断方法,对于犬瘟热病犬的早诊断、早隔离、早治疗具有重要意义。 本研究通过融合SP-2/0小鼠骨髓瘤细胞和纯化CDV免疫的小鼠脾细胞,获得了6株稳定分泌CDV抗体的杂交瘤细胞。利用双抗体夹心的原理,用柠檬酸钠还原法烧制的胶体金颗粒标记所获得的单抗,分别用G-蛋白亲和纯化的犬瘟热多抗和羊抗鼠二抗作为检测线和质控线,建立了犬瘟热病毒胶体金免疫层析诊断试纸条。与实验建立的犬瘟热直接免疫荧光诊断方法相比,具有相似的灵敏性和特异性(P0.05),而不需要荧光显微镜,更适合于临床和野外现场的使用。 利用CDV核蛋白基因构建的质粒pGEM-N作为荧光定量的绝对标准品,建立了Taq-Man探针实时荧光定量RT-PCR。建立的荧光定量标准曲线具有较高的相关性(R2≥0.994),可以在107~102个copies/μL范围内定量临床样本病毒的数量。与实验建立的犬瘟热病毒巢式RT-PCR诊断方法相比,具有相同的灵敏性和特异性(P0.05),但可以准确定量病毒载量。适合于犬瘟热的病程研究和预后评价。


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