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结核分枝杆菌H37Rv ORF组学研究

刘立国  
【摘要】: 结核分枝杆菌是结核病的致病菌,据世界卫生组织统计,近年来肺结核在全球各地死灰复燃,1995年全世界有300万人死于此病,是该病死亡人数最多的一年,大大超过了肺结核流行的1900年。在2003年3月24日“世界防治结核病日”之际,“制止结核病”世界行动组织公布的数字显示,目前全球每天仍有5000人死于结核病,而每年罹患结核病的人数超过800万由于人口剧增、移民增加、旅游业发展、耐药性的产生、人类免疫缺陷病毒感染流行、吸毒、酗酒与贫困等原因,结核病呈日益严重回升趋势。因此,对结核分枝杆菌基因组学研究、蛋白质组学研究、后基因组学研究等,表达后蛋白质组学研究,即从一个细胞生命整体去研究,方能彻底的弄清其分子致病机制、感染的方法,弄清结核分枝杆菌胞内生活周期,为结核分枝杆菌病早期诊断、疫苗免疫、新药研发,提供坚厚的理论基础。 1998年英国Sanger中心和法国Pasteur研究所科学家合作完成了结核分枝杆菌H37Rv株的全基因组测序工作,并在2002年进行了重新注释,这为结核病病原菌致病基因的研究提供了理论基础。结核分枝杆菌全基因组序列由4.41Mb(4.411529bp)组成,包括4411个基因,具有潜在编码能力的基因约有3977个,约占90.2%。有3924个开放阅读框,其中约40%有功能,44%可能有功能,16%称为孤儿序列,与其它微生物的序列无相似性。基因组富含GC碱基,G+C含量高达65.6%。虽然世界各地的实验室、医院、科研机构都在对结核分枝杆菌H37Rv做各方面的研究,但是尚无法克服结核病这一难题,越来越高的发病率和耐药菌株及多耐药菌株的出现,给结核分枝杆菌病的治疗增加了难度。本试验从整个基因组出发,利用Gateway技术,pDONR221为基因供体载体,pDEST17为表达载体,俩个表达菌株BL21和BL21Codonplus RP对结核分枝杆菌H37Rv进行不同诱导条件表达,丙烯酰胺凝胶电泳对表达蛋白验证,共对3056基因进行了克隆,得到入门质粒2903个,表达质粒2798个,表达蛋白1660个,其中纯化蛋白64个,有16个可溶性蛋白;选取重组表达,经酶解后得到的肽片段混合物,通过两维液相色谱分离,采用液质连用质谱方法对蛋白进行鉴定,确定属于结核分枝杆菌H37Rv。


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