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牛源致病性坏死梭杆菌分离鉴定及其白细胞毒素免疫特性研究

陈立志  
【摘要】: 坏死梭杆菌(Fn)是革兰氏阴性、严格厌氧的多形态细菌,是反刍动物和人发生各种坏死和化脓感染的主要致病菌,它所导致的坏死杆菌病呈世界性分布,是危害养牛业的重要传染病之一。本研究采用厌氧菌分离培养方法,分离了腐蹄病病牛蹄部脓肿组织病料中的专性厌氧菌,结合形态学、生化试验、动物接种试验和RNA聚合酶β亚单位(rpoB)特异性PCR试验,鉴定出4株坏死梭杆菌,分别为F1、F2、F3和F4;以本研究室保存的鹿源坏死梭杆菌(FnL)为参照,PCR扩增上述菌株的16S rRNA并测序,Blast分析结果证实所获得序列均为Fn 16S rRNA序列。以GenBank收录的Fn序列为参考(AF044948),对上述菌株进行系统发生分析,结果表明,F1株与其它菌株的亲缘关系较远。采用PCR方法进一步扩增上述菌株的白细胞毒素(lkt)启动子区序列,结果除F1外,F2、F3、F4和FnL株均能够获得阳性扩增产物(lkt启动子区517 bp),上述结果提示,F1株归属于Fn B亚型(Fnf亚种);而F2、F3、F4株归属于Fn A亚型(Fnn亚种)。 以分离的F4株基因组为模板,PCR扩增lktA的BSBSE基因和SH基因,将上述基因分别克隆到pMD18-T载体并测序,经与GenBank收录的lktA BSBSE和lktA SH核苷酸序列进行同源性分析结果表明,所获得序列与已知序列最高同源性分别达到99.1%和98.1%。将BSBSE基因和SH基因分别装入pET32a多克隆位点,构建pET32a-BSBSE和pET32a-SH表达质粒,经转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导后,SDS-PAGE检测,目的蛋白BSBSE和SH均获得表达;以牛源坏死梭杆菌阳性血清作为一抗,以辣根过氧化物酶标记兔抗牛IgG作为二抗,Western-blot检测BSBSE和SH均为本次研究的目的蛋白,具有反应原性;以BSBSE和SH分别制备的兔抗血清经间接ELISA检测效价均能达到105。并构建了pET32a-BSBSE-SH表达质粒,实现了BSBSE和SH融合表达,Western-blot检测BSBSE-SH融合蛋白具有反应原性。牛源致病性坏死梭杆菌的分离鉴定及其白细胞毒素融合基因的研究在国内尚属首次,本研究为研制更有效的诊断试剂和基因工程疫苗提供了基础数据。


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