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人源含硒单链抗体模拟谷胱甘肽过氧化物酶

霍锐  
【摘要】: 含硒谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是机体内最重要的抗氧化酶,已有许多GPX的人工模拟酶,但活力普遍不高。对已有的GPX模拟酶进行深入研究表明,产生底物结合位点是制备高活力GPX模拟酶的关键因素之一。单克隆抗体(McAb)制备技术是产生具有底物结合部位受体的有效手段。罗贵民小组在制备模拟GPX抗体酶的过程中,提出了疏水修饰理论并应用该理论制备了一系列具有较高GPX活力的单克隆抗体酶,在此基础上又应用基因工程方法制备了模拟GPX的小分子单链抗体(scFv)酶。这些抗体酶虽然活性较高,但来源于鼠的免疫原性限制了它们的医学应用。本研究的主要目的就是制备具有一定GPX活力的人源单链抗体酶,并在细胞水平上研究其抗氧化作用。主要开展了以下工作: 1.合成抗原GSH-S-DNPBu 根据罗贵民小组提出的疏水修饰理论合成了谷胱甘肽(GSH)的类似物GSH-S-DNPBu,用核磁共振对合成的化合物进行了分析。 2.亲和筛选抗GSH-S-DNPBu的噬菌体单链抗体 通过吸附-洗脱-扩增步骤,从噬菌体展示人源单链抗体库(human synthetic VH+VL scFv library)中亲和筛选抗GSH-S-DNPBu的噬菌体单链抗体。用“多克隆噬菌体ELISA”监测筛选过程并用“单克隆噬菌体ELISA”选择可以和GSH-S-DNPBu特异性结合的单克隆噬菌体。 3.表达和纯化人源单链抗体 根据“单克隆噬菌体ELISA”结果,提取选择的单克隆噬菌体DNA,应用PCR方法从噬菌体DNA中扩增出编码人源单链抗体的基因,将其克隆到分泌性表达载体pPELB中并转化大肠杆菌Rosetta,诱导转化菌Rosetta表达人源单链抗体。用Ni2+螯合亲和层析(IMAC)纯化可溶性表达的人源单链抗体。应用SDS-PAGE和western blot实验鉴定表达和纯化的人源单链抗体。 4.制备人源含硒单链抗体酶 用化学突变法将人源单链抗体中的丝氨酸转变为硒代半胱氨酸(Sec),得到具有GPX活力的人源含硒单链抗体酶,其活力为1288 U/μmol。 5.在细胞水平上研究人源含硒单链抗体酶的抗氧化作用 利用H2O2损伤大鼠乳鼠的心肌细胞建立氧化应激损伤模型,应用MTT法,丙二醛(MDA)测定试剂盒,乳酸脱氢酶(LDH-L)比色法试剂盒,流式细胞仪和活性氧测定试剂盒检测受损细胞的存活率、脂质过氧化程度、心肌细胞膜完整性、线粒体膜电位和细胞内ROS水平等指标的变化以及人源含硒单链抗体酶对上述指标的影响。结果表明人源含硒单链抗体酶能部分的增加心肌细胞存活率,减少脂质过氧化产物MDA生成,降低由于细胞膜完整性受损而引起的LDH泄漏,恢复线粒体膜电位,降低细胞内ROS含量,表明人源含硒单链抗体酶具有很强的抗氧化能力和良好的药用前景。


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