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长白山温泉嗜热微生物的分离鉴定及新型嗜热脂肪酶性质研究

蔡锦刚  
【摘要】: 近年来,嗜热微生物特殊的生理生化特征和嗜热酶独特的生物稳定性和催化活性得到科学研究者的关注,推动了酶学和酶工程理论的发展,为酶的工业应用奠定了基础。地球上地热高温环境蕴藏着大量的嗜热微生物资源,30年来已经有超过80个新属150种嗜热菌被分离鉴定。中国是世界上地热环境最丰富的国家之一,然而对于具有“温泉之最”之称的长白山温泉的研究却几乎为空白。长白山独特的火山地质地貌及其特殊的地理环境决定了它是一个非常原始的生态系统,众多的高温温泉蕴藏着丰富的嗜热微生物和基因资源。本论文以长白山温泉为考察对象,分离鉴定长白山温泉嗜热微生物,克隆、表达嗜热脂肪酶基因,并系统研究新型嗜热脂肪酶性质。 根据长白山温泉多发性特点,采集不同温度温泉区的土样和水样,利用选择性嗜热菌培养基富集培养样品;通过传统的平板分离,结合梯度稀释的方法成功分离9株不同嗜热程度的嗜热菌。16S rRNA序列同源性比对和系统发育学分析表明它们分属于两个嗜热细菌科中的三个属。对其中的两株潜在新种进行了系统的多相分类学鉴定,结果表明它们是Fervidobacterium属中的新种,,因此建议将菌株CBS-1~T和CBS-4~T归于超嗜热细菌Fervidobacterium属中的两个新种,分别推荐命名为Fervidobacterium changbaicun和Fervidobacterium tianchisum,标准菌株CBS-1~T (=DSM17883~T=JCM13353~T),CBS-4~T (=JCM14752T)。 以F. changbaicum CBS-1基因组为模板,以设计的系列保守脂肪酶氧离子洞和丝氨酸活性部位区域的核苷酸作为引物,随机组合进行PCR;通过Genome walking和巢式PCR后进行序列组装,成功地获得了嗜热脂肪酶基因CF7F。序列同源性分析表明它与已知存在的脂肪酶基因的同源性低于30%,与脂解酶家族V的成员具有相对高的相似性。该脂肪酶是第一个来自超嗜热微生物的脂肪酶。对重组酶进行了系统的酶学性质表征及稳定性机制研究,结果表明该脂肪酶的最适温度为78℃,最适pH为7.8,具有高热稳定性,广泛的pH耐受性以及较宽的底物谱,该酶为超嗜热细菌科Thermotogaceae中的第一个被系统表征的脂肪酶,其高稳定性和广谱底物的催化特性表明它是一个具有工业应用潜力的新型嗜热脂肪酶。


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