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荧光假单胞菌脂肪酶的克隆表达、酶学性质及其在手性拆分中的应用研究

张爱军  
【摘要】: 假单胞菌脂肪酶在催化酯水解、酯合成和酯交换反应中常常表现出很高的选择性,因此广泛应用于制药和农药等许多领域中。多年来的研究表明,假单胞菌脂肪酶基因在E. coli中的表达大多以没有活性的包涵体形式存在,这极大地限制了经济而高效的E. coli表达系统在其表达上的应用。本论文中我们采用PCR的方法,从可降解有机溶剂的Pseudomonas fluorescens JCM5963菌株中成功克隆了一个新的脂肪酶基因PFL296,并以有活性的聚集体的形式在E. coli中实现了高水平的表达。通过对重组酶性质表征发现,PFL296编码的酶蛋白PFL的分子量是32 426 kD,最适温度为55℃,最适pH值为8.8,具有较好的低温水解能力和高温活性,具有较宽范围的pH稳定性以及碱性作用条件,因此具有作为洗涤剂用酶的应用潜力。重组PFL的另一个重要性质是在多种水溶性有机溶剂的存在下得到激活并保持稳定,对一些水不溶性的有机溶剂也具有一定的耐受性,这些特点使其具有很好的应用于有机合成的潜力。在此基础上,本文对重组PFL在立体选择性拆分(R, S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸((R, S)-NEMPA)和(R, S)-2-辛醇中的应用进行了研究。结果表明,重组酶的粗酶聚集体和全细胞酶制剂形式都分别表现出了较好的实际应用价值。


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