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蛋白质芯片检测病原微生物与毒素的研究

路浩  
【摘要】: 2001年美国发生的炭疽邮件事件,再次引起各国对生物恐怖的关注。如何应对生物恐怖袭击,特别是建立高通量、快速的侦检技术,已经成为许多国家研究的重点。蛋白质芯片检测技术由于具有高通量、简便快速的特点受到了人们的广泛重视,利用蛋白质芯片检测病原微生物和生物毒素的相关研究国内还未见报道。 本研究通过细菌LPS提取、病毒蛋白纯化和杜素蛋白提取纯化等抗原制备过程,得到检测抗原。包括:禽流感病毒、新城疫病毒、大肠杆菌O157、牛、羊布氏菌及LPS成份、蓖麻毒素、相思子毒素;使用羊布氏全菌免疫Balb/C小鼠,取其免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合,有限稀释-ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,制备获得了羊布氏菌单克隆抗体。复苏了6株冻存的杂交瘤细胞,得到了其他6种单克隆抗体,并测定了单克隆抗体的亲和力和效价等指标;优化了蛋白质芯片点样条件,确定了适合的蛋白点样浓度。优化了最佳的点样温度、湿度及芯片后处理方法;通过优化芯片杂交反应,获得了蛋白芯片的杂交温度、杂交时间、杂交样品浓度等条件。确定的芯片制作及杂交反应条件,蛋白点样浓度:相思子毒素为0.8μg/mL、蓖麻毒素为1μg/mL、牛布氏菌2.5 mg/mL、羊布氏菌2.5 mg/mL、大肠杆菌O157为3.0 mg/mL、新城疫病毒为0.5 mg/mL、禽流感病毒为0.8 mg/mL。点制好的芯片在4℃真空状态12 h后。单克隆抗体以5μg/mL的终浓度作为捕捉抗体,样品与单克隆抗体1∶1混匀,37℃1 h。反应产物加到芯片上37℃1 h。Cy3标记的羊抗鼠IgG以3.3μg/mL的浓度标记芯片上的抗体,37℃1 h;研究表明,该方法具有高通量(同时检测7种病原微生物和毒素)、高灵敏度(最低检测限:禽流感病毒10μg/mL,新城疫病毒9.4μg/mL、大肠杆菌O157 3.0×10~3 CFU/mL,羊布氏菌2.5×10~3CFU/mL,牛布氏菌2.5×10~3 CFU/mL,蓖麻毒素0.05μg/mL、相思子毒素0.05μg/mL)、简便快速(检测周期为2 h)的特点。 本研究建立了检测7种病原微生物及毒素的蛋白质芯片检测方法,制备了能同时检测7种病原微生物和毒素的蛋白质检测芯片。使用该芯片对模拟样品(土样、奶样、水样)进行了检测,检测结果表明,该芯片可以准确快速地检测出病原微生物和毒素。


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