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应用酵母双杂交系统对PrP蛋白与Shadoo蛋白互作的研究

郝镯  
【摘要】: 本课题通过扩增小鼠朊蛋白开放阅读框(PrP23-231)中十二段不同长度的基因片段,分别构建酵母双杂交诱饵质粒pSos-PrP(23-216)、pSos-PrP(23-198)、pSos-PrP(23-192)、pSos-PrP(23-178)、pSos-PrP(23-163)、pSos-PrP(23-159)、pSos-PrP(23-153)、pSos-PrP(23-142)、pSos-PrP(23-130)、pSos-PrP(23-126)、pSos-PrP(23-108)、pSos-PrP(23-90)等十二个重组质粒,检测诱饵质粒在酵母细胞质中的自激活作用及定位情况,结果证明此十二个诱饵质粒无自激活作用可以应用于CytoTrap酵母双杂交系统;扩增Shadoo(简写为SHo)蛋白开放阅读框(SPRN25-125)五段不同长度的基因片段,构建pMyr-SHo(25-61)、pMyr-SHo(25-77)、pMyr-SHo(25-85)、pMyr-SHo(25-100)、pMyr-SHo(25-111)等五个猎物质粒,利用Stratagene CytoTrap酵母双杂交系统,通过共转化实验,初步筛选到pSos-PrP(23-126)与pMyr-SHo(25-77)能够发生相互作用;构建PCMV-MYC-PrP及PCMV-HA-Sho真核表达载体,在293细胞中进行免疫共沉淀实验,进一步验证PrP(23-126)与SHo(25-77)的互作效应,最终确定,PrP与Shadoo蛋白是互作蛋白。


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