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重组人OSM的制备及诱导肝癌细胞分化的实验研究

孔宁  
【摘要】: 抑瘤素M(OSM)能够诱导多种肿瘤细胞,如神经胶质瘤、骨肉瘤、乳腺癌、肺腺癌、白血病细胞发生形态和/或功能上的分化成熟。OSM对胚胎及成体肝脏均具有独特的生物学作用。鉴于此,本研究围绕OSM对肝癌细胞的诱导分化作用进行了如下工作。利用基因重组技术构建了毕赤酵母真核表达载体pPICZαC-hOSM,电转化毕赤酵母X-33,筛选出能够稳定高效分泌表达重组人OSM(rhOSM)的工程菌。经SDS-PAGE、Western Blot、N-末端15个氨基酸残基序列分析、AKTA explorer多功能纯化系统纯化、质谱测定其相对分子质量及体外活性检测,证明应用毕赤酵母表达系统分泌表达的rhOSM与天然OSM具有相同的理化性质和生物学活性。利用80 L发酵罐进行rhOSM中试规模发酵,并对其发酵条件进行优化,rhOSM表达量达到280 mg·L-1。同时建立了一种分离纯化rhOSM的新方法。 利用光镜、透射电镜、MTT、RT-PCR、免疫荧光、免疫细胞化学染色、流式细胞术等方法和技术,体外水平观察rhOSM对人肝癌细胞SMMC-7721生长的抑制作用、细胞形态、超微结构、信号传导分子、细胞周期和凋亡率的影响及诱导肝癌细胞分化的相关生化指标的检测。结果表明rhOSM能够抑制SMMC-7721细胞生长、诱导其分化、促进其凋亡。通过观察rhOSM对BALB/c小鼠肝癌细胞H22皮下移植瘤生长的抑制情况、外周血中AFP水平、瘤组织病理学改变,表明rhOSM对小鼠肝癌细胞具有抑制生长、促进分化的作用。实验结果同时表明,短期腹腔注射rhOSM对小鼠肝脏、脾脏没有造成损伤,但对小鼠胸腺组织具有抑制作用。 本研究创新之处:1)利用80 L发酵罐进行了rhOSM毕赤酵母工程菌的中试规模发酵,对其表达条件进行优化,并建立一种适用于大规模分离纯化rhOSM的方法,证实应用毕赤酵母表达系统表达的rhOSM与天然OSM具有相同的理化性质和生物学活性; 2)从体内、体外水平,全面、系统地研究了rhOSM对肝癌细胞的作用,证实rhOSM能够抑制肝癌细胞增殖、诱导其分化和凋亡。国内外未见相关报道。


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