狂犬病病毒CTN株反向遗传系统的建立

【摘要】： 反向遗传学是对遗传信息为RNA的生命体而言,在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰再按基因组组成顺序构建含有生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体。本研究对建立中国疫苗株狂犬病病毒反向遗传系统的成功探索,为进一步研究狂犬病病毒基因组结构与功能的关系,开发新型疫苗提供技术平台。 本研究建立了中国人用疫苗株(CTN)狂犬病病毒反向遗传系统,其中主要元件包括:两端分别带有锤头状核酶(HamRz)和丁型肝炎核酶(HdvRz)并在G、L基因之间插入绿色荧光蛋白(GFP)基因的全长基因组cDNA重组真核表达质粒,以及核蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(L) 3个参与病毒转录和复制的辅助质粒。方法是将上述4个质粒共转染BHK-21细胞,在细胞RNA聚合酶II的作用下启动真核表达载体pVAX1的CMV启动子起始转录各个目的基因,成功拯救出CTN株重组狂犬病病毒(CTN-GFP),通过感染重组病毒的细胞传代实验证明此病毒能够稳定表达GFP。重组病毒CTN-GFP分别脑内接种1日龄乳鼠和成年小鼠,结果导致乳鼠全部发病死亡,并在发病死亡的乳鼠脑内检测到绿色荧光蛋白的表达,而对成年鼠不致病,提示此病毒具有与亲代CTN株病毒相似的致病特性。