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定向进化及定点突变提高枯草芽孢杆菌脂肪酶的活力和立体选择性

赵博  
【摘要】: 脂肪酶作为一类重要的生物催化剂被广泛应用在工业生产和科学研究中。枯草芽孢杆菌脂肪酶A(LipA)是第一个获得晶体结构解析的芽孢杆菌脂肪酶,它的酶学性质、催化机理、稳定性以及立体选择性是近年来研究的热点。 本研究从枯草杆菌Bacillus subtilis 168中克隆、表达并纯化了脂肪酶LipA,并将其保守五肽序列Ala-X-Ser-X-Gly的Ala突变成了Gly。这个突变使得脂肪酶在拆分扁桃酸乙酯时,立体选择性提高为野生酶LipA的3倍,活力有所降低,通过动力学参数Km值和kcat值的变化对活力和立体选择性的影响进行了解释,同时测定了酶催化对硝基苯酚辛酸酯的水解反应动力学参数。 为了进一步提高A75G的立体选择性,对LipA中另一个重要位点Asn18进行了定点饱和突变,并结合高通量筛选的方法筛选立体选择性提高的突变体,最终获得了E值为19.1的突变体。在筛选的过程中,使用(R,S)-扁桃酸-(S)-2-辛酯做为底物,得到的突变体对手性2-辛醇的立体选择性也得到了提高,这是一种同时提高酶对两种对映体底物立体选择性的新的筛选方法。 我们还通过定向进化和高通量筛选的方法,提高了枯草杆菌脂肪酶BSL2的活力。并将野生酶和突变酶与底物对接,通过结构变化解释了活力提高的原因,揭示了酶结构与功能的关系。


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