基于λ red系统的大肠埃希菌基因及操纵子重组突变体的构建

【摘要】： 细菌学的研究尤其是将大肠埃希菌作为革兰氏阴性菌的代表将枯草芽胞杆菌作为革兰氏阳性菌的代表进行研究,可为细菌的生理、生化和致病性研究提供基本数据。 微生物学研究对于人类研究抗菌药物、保护自身健康具有重要意义,同时也有助于我们更为清晰的理解微生物作为一个整体系统发挥功能。 因此,随着多种微生物基因组数据在基因数据库中的可用查询,以及相关数据的指数级增长,目前以及未来人类为所面临的巨大挑战再也不是如何获取不同生物的基因组数据,而是要了解其运作模式,以及控制其发挥某一生理或病理功能的相互作用。 基因功能的研究始于Mendel时代直至现在。近年来,通过对基因序列进行修饰或敲除使得检测被修饰的或缺失的基因的确切功能成为可能。反义遗传学研究已成为个体或整体基因功能研究最为重要和直接的工具。 多种技术已被开发,包括定点诱变技术(即局部地,考虑到一个基因序列的几个核苷酸),部分或全部基因敲除,利用游离的DNA片段或携带失活序列的质粒进行替代。 近年来,λ噬菌体Red重组酶系统已用于灭活大肠埃希菌中K-12染色体基因,通过利用线性PCR产物进行同源重组实现该灭活作用。在本研究中,采用改进方法即包括灭活与再插入两个步骤,改变基因组中基因定位,构建大肠埃希菌BW25113突变体。通过两侧带有FLP识别靶点的卡那霉素盒取代相应基因的开放读码框及其调控区,从而灭活该基因。插入位点的选择基于基因间的距离以及非编码区,因此新的比邻基因序列并未受影响。通过设计与插入位点具有同源序列的引物来完成再插入过程,该引物包含酶切位点,以便于在电穿孔前将PCR产物与FRT-kan-FRT靶标进行连接。通过PCR反应、在培养集中加入适当的抗生素以及基因表达比较研究等方法,确认基因的敲除、插入以及在新位点基因的表达情况。该研究方法以及构建的大肠埃希菌突变体可有效地用于细菌基因组学研究,特别是系统生物学研究,以理解和揭示某基因在基因组中的位置与该基因及其比邻基因以及其它相同功能组的基因表达之间的关系。由此产生的数据可以提高我们对于细菌的基因组织与排列规律的认识。