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重组嗜热闪烁杆菌脂肪酶系的性质表征及嗜热磷酸三酯酶晶体结构解析

于珊珊  
【摘要】: 来源于嗜热微生物的嗜热酶具有独特的生物稳定性和催化活性,对嗜热酶结构-功能关系的研究已得到越来越多科学工作者的关注,该领域研究不仅将加深酶学和酶工程理论的发展,也为酶的工业应用奠定了基础。 论文第一部分克隆、表达、纯化和表征了来源于嗜热菌Fervidobacterium nodosum Rt17-B1的嗜热脂肪酶(FnL)和嗜热酯酶(FNE)。(1)FnL的序列同源性分析表明它与已知存在的脂肪酶基因的同源性低于30%,系统发育学分析表明它属于脂肪酶家族I,但与脂解酶家族I中现有的7个亚家族亲缘关系较远,因而将此嗜热脂肪酶所在的分支确定为脂肪酶家族I中的一个新的亚家族,并命名为family I.8;该重组脂肪酶的最适反应温度为70℃,最适pH为9.0,并且具有较高的热稳定性,其在60°C保温50小时几乎没有活力损失。底物选择性分析表明FnL偏好于水解中长链酰基(C_8-C_(12))的p-nitrophenyl酯底物,最适底物为p-nitrophenyl caprate,另外,FnL还能够水解链长在C_4到C_(16)范围的三甘油酯底物,最适底物为三丁酸甘油酯(C_4)。结构建模和分子模拟研究揭示了FnL发挥催化作用的结构基础及其底物选择性的分子机制。(2)FNE的序列同源性分析表明其与已知存在的GDSL酯酶基因的同源性低于30%,在其序列中发现了SGNH亚家族蛋白的4个保守模块,即Block I,Block II,Block III和Block V,推测其可能的催化三联体为Ser~8, Asp~(215)和His~(218),氧洞基团为Ser~8, Gly~(33)和Asn~(66)。该酯酶是GDSL家族中第一个来自嗜热微生物的酯酶。重组酶的最适反应温度为75℃,最适pH为8.5,FNE偏好于短链酰基(≤C_4)酯底物,最适底物为p-nitrophenyl acetate,它无法催化链长大于8的p-nitrophenyl酯底物的水解。通过与已知结构的酯酶进行结构比对,研究发现FNE位于活性位点之上存在一段插入序列,可能阻止了像三甘油酯等较大的底物分子与酶活性部位的接近,使FNE只能催化短链底物的水解。 论文第二部分运用蛋白质晶体学的技术对重组FnL、FNE以及嗜热菌Geobacillus kaustophilus HTA426的磷酸三酯酶GK1506进行结晶和结构解析。成功地获得了磷酸三酯酶GK1506的结晶,使用分子置换法解析了分辨率达2.6 A的晶体结构。结构分析表明: GK1506蛋白的三维结构为TIM滚筒状结构,活性位点由β折叠的C末端以及连接这些折叠和螺旋之间的loop构成,同时活性部位结合有两个Co~(2+);另外GK1506蛋白结构具有与其他OPH蛋白相似的三个结合口袋,分别是大的结合口袋,小的结合口袋和离去集团结合口袋。另外我们还通过定点突变确定了参与催化作用的重要氨基酸残基为His23,His25,His178,His206,Lys145和Asp266。GK1506与有机磷底物的对接实验结果表明,在该酶活性中心上方存在一个由柔性较高的loop形成的盖子结构,推测该段loop所具有的“开-关”功能的结构变化可能与酶分子的底物进出和对有机磷底物或内酯类底物的选择性机制有关。以上关于嗜热磷酸三酯酶晶体结构的研究为揭示结构与功能关系以及为蛋白质合理设计方面的研究奠定了理论基础。


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