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羊传染性脓疱病毒重组DNA疫苗的构建与实验免疫研究

赵魁  
【摘要】: 养羊业是我国畜牧业的一个重要内容,然而,长期以来,养羊业并未象养猪业、养鸡业等一样受到人们的重视,因此仍处于较为落后的状况。此外,羊群密度的增大、频繁的从外地引种以及粗放的饲养管理等因素的存在导致羊痘、羊传染性脓疱病、蓝舌病、坏死杆菌病等一些严重危害养羊业发展的疾病的频繁发生。羊传染性脓疱病作为羊群中常见的病毒性传染病之一,严重威胁着养羊业的健康发展。近年来,该病的发生呈上升趋势,因此不断有该病发生和流行的报道。本研究对长春市郊养羊户饲养羊群中一起疑似羊传染性脓疱病例进行分析,根据流行病学特点、临床症状和系统的病理学观察以及分子生物学检测等实验室诊断结果,证实该病为羊传染性脓疱病。然后利用原代犊牛睾丸细胞从病羊唇部痂皮中成功分离获得1株病毒,并通过形态学观察、理化学测定、动物回归试验和PCR等方法对该病毒进行鉴定,证实其为羊传染性脓疱病毒(ORFV),被命名为ORFV/JL/08/CC。将经超速离心纯化的病毒免疫家兔制备出多抗,通过免疫组织化学检测病原在各组织脏器中的分布情况,结果显示,在感染唇部皮肤棘细胞的胞浆中表现出阳性反应,从而进一步证明了该病的发生原因为感染ORFV所致。而对ORFV/JL/08/CC分离株的分离鉴定为进行针对羊传染性脓疱病的疫苗研制提供物质条件。然后利用PCR扩增获得该病毒株的主要免疫原性基因ORFV 011(B2L)和ORFV 059(F1L),测序后提交Genbank收录(登录号分别为FJ808074和FJ808075)。此外,从氨基酸和核苷酸水平上对其同源性进行分析,同时对两基因进行了遗传进化分析。结果表明,该分离株的ORFV 011(B2L)和ORFV 059(F1L)基因高度保守,可作为核酸疫苗研制的目的基因。在获得ORFV 011(B2L)和ORFV 059(F1L)的基础上,利用一编码(G4S)2多肽的碱基linker连接并通过重叠PCR的方法扩增获得ORFV 011(B2L)-linker-ORFV(F1L)融合基因,在此基础上,利用pcDNA3.1(+)真核表达载体成功构建了相应的疫苗质粒,通过脂质体法将其分别转染MDBK细胞,并通过RT-PCR、间接免疫荧光、SDS-PAGE以及Western-blotting等方法从mRNA水平和蛋白水平上证实了目的基因在动物细胞的转录和表达,这将为我们后续进行的动物免疫试验提供理论依据。采用初免-加强免疫的策略,将制备纯化的疫苗质粒经肌肉注射免疫Balb/c小鼠,之后通过间接ELISA、淋巴细胞增殖试验、流式细胞术等方法对疫苗质粒引起机体特异性的细胞免疫应答和体液免疫应答水平进行检测,结果表明,构建的疫苗质粒能够诱导免疫小鼠产生特异性的细胞免疫应答和体液免疫免疫应答,且以Th1型免疫应答为主;攻毒试验结果表明所构建的疫苗质粒安全性好,且能提供有效的免疫保护,该研究结果将为后续进行羊只免疫试验及其在临床上的应用奠定基础。


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