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特异性多结构域DNA转导重组嵌合体在毕赤酵母中表达及其体内外转导作用

杨恩成  
【摘要】: 本研究利用分子生物学和免疫学等技术和手段,探索了利用多结构域嵌合蛋白提高裸质粒DNA转导效率的问题。首先,在PCR方法分别克隆了GAL4/147、NLS-GAL4/147、Tat-GAL4/147和Tat-NLS-GAL4/147序列,并将其克隆于酵母表达载体pPIC9K,成功构建了酵母表达质粒pPI-G、pPI-NG、pPI-TG和pPI-TNG,并在酵母菌株GS115内对目的蛋白进行了表达,通过对表达时间、温度、转速、甲醇浓度等条件的优化,最终获得了目的蛋白G、NG、TG和TNG。 基于GAL4特异性识别/结合序列UAS、EGFP基因和Apoptin基因,成功构建了能够被融合蛋白特异性识别/结合的真核表达质粒DNA,并在体外对融合蛋白与UAS质粒的结合效率和条件进行了探索。通过MTT染色、AO/EB染色、流式细胞术、AnnexinV染色、DAPI染色、Caspase活性检测等方法探讨了融合蛋白介导的重组质粒对人肝癌细胞HepG-2的转导和抑制作用。实验结果表明,融合蛋白能够有效介导重组质粒对人肝癌细胞HepG-2的转导,并能够实现对人肝癌细胞HepG-2生长的抑制。 本研究复制了C57BL/6小鼠荷小鼠肝癌(H22)肿瘤模型,通过瘤内注射融合蛋白-重组质粒复合物的方式,检测抑瘤率、生存期等指标,探讨了融合蛋白介导的重组质粒在动物体内的转导作用和对体内实体肿瘤的抑制作用。实验结果表明,融合蛋白在动物体内也可有效介导重组质粒的转导,并能够实现对C57BL/6小鼠荷小鼠H22肿瘤模型实体肿瘤的抑制。 上述研究为研制安全、高效、低毒的裸质粒DNA转导辅助系统,拓展裸质粒DNA的应用空间奠定了基础。


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